本文介紹了實(shí)驗(yàn)室常見的液相檢測器的原理,并對它們在實(shí)踐中的應(yīng)用的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析。
01
紫外-可見光檢測器
紫外檢測器是應(yīng)用最廣泛的檢測器,幾乎所有的液相儀都配有該檢測器,絕大部分藥物在該檢測器中都有響應(yīng)。它常見的兩個(gè)小分支是可變波長檢測器和二極管陣列檢測器。
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原理
遵循的是朗伯比爾定律:當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí),其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度c及吸收層厚度b成正比。如果厚度固定,公式可表示為A=kc。也就是說,理論上供試品的響應(yīng)值與濃度做線性回歸的話,應(yīng)該是一條經(jīng)過原點(diǎn)的曲線。這就是含量測定外標(biāo)法的理論依據(jù),但實(shí)際上由于儀器的進(jìn)樣誤差、人員操作誤差、流動(dòng)相的本底吸收等因素的影響,線性不可能經(jīng)過原點(diǎn),線性方程中都有一個(gè)不是零的截距。這就是對照品濃度和供試品濃度應(yīng)接近的原因,線性如果經(jīng)過原點(diǎn),任何對照品的濃度都可以用來測定供試品的結(jié)果。線性不經(jīng)過原點(diǎn),對照品濃度與供試品濃度相差越大,計(jì)算結(jié)果誤差越大。由這個(gè)討論我們又扯出另一個(gè)話題,就是有關(guān)物質(zhì)檢測項(xiàng)的自身對照溶液濃度應(yīng)該是多少的問題。比如原料藥,有將供試品稀釋1000倍,有稀釋100倍的,到底哪個(gè)濃度合適?我想之前的討論可以給出一個(gè)合理的答案了,就是如果截距很小,二者區(qū)別不大,隨便那個(gè)濃度都可以。如果截距較大,則應(yīng)選擇和雜質(zhì)規(guī)定限度附件的濃度,一般是稀釋1000倍。較小或者較大怎么判斷,個(gè)人認(rèn)為可以5%為分界線。當(dāng)然,最終還是看回收率的結(jié)果,能夠滿足回收率的要求就可以。
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優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)很多,讓人印象深刻的就是憨厚,等度梯度緩沖鹽隨便用,好說話的一塌糊涂。還有就是供試品的量與響應(yīng)者呈良好線性,方便計(jì)算檢測結(jié)果。另外適用范圍較廣,只要有紫外吸收的物質(zhì)都可以應(yīng)用。
缺點(diǎn)不多,個(gè)人認(rèn)為最大的缺點(diǎn)只有兩個(gè):一個(gè)是樣品必須有紫外吸收,另外一個(gè)就是對流動(dòng)相有一定的要求,流動(dòng)相的紫外吸收應(yīng)盡可能的小,否則會有較大的本底吸收。本底吸收也是截距的一大來源,樣品的響應(yīng)等于本身的吸收減去流動(dòng)相本底吸收,如果本底吸收為固定值b的話,樣品在儀器上實(shí)際的響應(yīng)者為A=kc-b。流動(dòng)相的影響在有關(guān)物質(zhì)檢測中較為明顯,因?yàn)殡s質(zhì)量小,響應(yīng)弱,流動(dòng)相的影響就較大,這個(gè)需要注意。就是說開發(fā)方法時(shí)檢測波長應(yīng)盡可能大于流動(dòng)相的截止波長。
02
示差折光檢測器RID
RID是一種通用檢測器,對所有樣品都有響應(yīng)。
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原理
示差檢測器是基于連續(xù)測定樣品流路和參比流路之間折射率的變化來測定樣品含量的。光從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時(shí),由于兩種物質(zhì)的折射率不同就會產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動(dòng)相的折光指數(shù)不同,就可被檢測,二者相差愈大,靈敏度愈高,在一定濃度范圍內(nèi)檢測器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比。
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優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)是通用,沒有不能檢測的。
最大缺點(diǎn):靈敏度低,一般來說有關(guān)物質(zhì)檢測不能用它,RID一般用于含量測定;另一個(gè)缺點(diǎn)由它的原理決定,只能等度,所以多組分的分離存在問題。還有平衡時(shí)間過長,對環(huán)境要求高(尤其是室溫的波動(dòng))也是讓操作人員困擾的因素。
03
蒸發(fā)光散射檢測器ELSD
一種新型的通用檢測器,用于不易揮發(fā)的組分。靈敏度一般來說介于紫外檢測器和示差折光檢測器之間。
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原理設(shè)
用惰性氣體霧化洗脫液,在加熱管(漂移管)中將流動(dòng)相蒸發(fā),樣品顆粒進(jìn)入檢測器散射激光光源發(fā)出的光,光信號轉(zhuǎn)化為電信號被輸出。
原理看起來很高大上,且靈敏度也還可以,面對如此多的沒有紫外響應(yīng)的化合物,理論上說應(yīng)該可以一統(tǒng)江湖了。事情總有但是,下個(gè)章節(jié)詳細(xì)評論ELSD的優(yōu)缺點(diǎn)。
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優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)就是通用,不論有沒有紫外響應(yīng),它都有響應(yīng),只要揮發(fā)性弱于流動(dòng)相即可。且可以走梯度,可以用于分離復(fù)雜的混合物。
但是……缺點(diǎn)也很多。最大的也是最讓人無法接受的缺點(diǎn)是濃度與響應(yīng)者不呈線性,二者的對數(shù)呈線性關(guān)系。線性非常差,線性范圍不大,相關(guān)系數(shù)非常差,還有截距非常大。由于這個(gè)缺點(diǎn),我想大家已經(jīng)明白該檢測器單點(diǎn)外標(biāo)法絕不可行,所以該檢測器一般用于外標(biāo)兩點(diǎn)法(供試品響應(yīng)值需在兩個(gè)對照品之間,不允許外延)檢測含量;有關(guān)物質(zhì)很少用該檢測器。大家應(yīng)該能夠理解,每個(gè)雜質(zhì)都要配制兩個(gè)不同濃度的對照品溶液,且供試品響應(yīng)值在兩個(gè)對照之間(做不到的,雜質(zhì)的量無法預(yù)測,不像含量),這是一間多么讓人崩潰的事情。
另一個(gè)缺點(diǎn)是流動(dòng)相需要能揮發(fā),也就是意味著不能存在不易揮發(fā)的組分,也就是說最常用的磷酸鹽系列不能用了。還有需要提高氣體,操作繁瑣,會產(chǎn)生有害氣體等。
04
其他
還有電化學(xué)檢測器、化學(xué)發(fā)光檢測器等因?yàn)閼?yīng)用太少筆者本人也不懂不知道怎么寫,就不在本文中介紹。
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