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重組蛋白藥物是生物藥物中的核心產品，主要是通過基因工程菌來生產功能蛋白或其突變體，用于彌補體內蛋白的缺失，從而對疾病的治療發揮關鍵作用。近年來，重組蛋白藥物在疾病治療中發揮作用越來越大，相關技術也發展迅速。重組蛋白藥物種類繁多，包括多肽藥物、基因工程藥物、重組蛋白疫苗、抗體類藥物等。相較于傳統藥物，重組藥物活性、特異性均更高，且毒性低，更加安全有效。目前，市場上重組蛋白藥物表現為胰島素、激素、人造血因子、尼妥珠單抗等，臨床應用廣泛。重組蛋白藥物的整體產業鏈分為上、中、下游，其中上游是基于基因工程技術、細胞工程技術的研發環節，中游為藥物及給藥系統生產制造，包括大規模細胞培養、重組蛋白純化與質控。

1、重組蛋白藥物生產的表達系統

目前在工業應用中，涉及到多種重組表達系統，其中在生產重組蛋白藥物中，主要應用大腸桿菌、酵母和哺乳動物 CHO 細胞系 3 種表達系統。在3種表達系統中，大腸桿菌系統最為簡單。此系統涵蓋多種類型的菌株，這些菌株的主要差異在于篩選標記、誘導方式、有無信號序列、營養缺陷型及特殊蛋白質折疊機制。對于大腸桿菌的基因工程改造更好地完善了大腸桿菌表達系統，如編碼二硫鍵異構酶的基因已穩定整合到大腸桿菌的基因組中，確保蛋白正確折疊，提高胞內蛋白的折疊和溶解性。重組蛋白在大腸桿菌周質空間中的有效分泌可提高大腸桿菌表達的蛋白可溶性。大腸桿菌表達系統主要用于多肽類藥物的生產，如重組人胰島素和重組甲狀旁腺激素等。

酵母系統主要包括釀酒酵母和畢赤酵母，此外還包括一些非傳統的酵母種類，如漢森菌多形酵母、脂酵母、裂殖酵母和乳酸克魯維酵母菌也已發展為合成各種不同特性蛋白藥物的宿主。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是廣泛研究的酵母表達系統之一，用于生物制藥合成的宿主。糖基化是重要的翻譯后修飾之一，盡管酵母可以進行N?糖基化和O?糖基化，但與人源細胞的糖基化模式有顯著差異，其分泌的重組蛋白會形成α?1，3?甘露糖化，導致蛋白免疫原性增加、半衰期縮短。通過在酵母中準確引入人源糖基轉移酶和糖苷酶，刪除超甘露糖化基因，可以使酵母糖基化途徑與人糖基化途徑相似，從而保證治療蛋白的藥代動力學特性。畢赤酵母（Pichia pastoris）生長快，發酵細胞濃度高，可產生大量重組人源蛋白。畢赤酵母系統能夠靈活地選擇合適的載體和兼容宿主，高效、經濟地表達重組蛋白，保證產品成功開發。

CHO 細胞系是一種來源于中國倉鼠卵巢的上皮細胞系，能夠產生人同源性蛋白。人體組織纖溶酶原激活劑是1986 年第一個在 CHO 細胞系中成功生產并批準臨床使用的重組治療蛋白。隨后，越來越多的治療性蛋白質在哺乳動物細胞中被制造出來，并且隨著工藝的優化，在該表達系統中生產重組蛋白的技術得到了迅速發展。

在廣泛篩選表達系統時，蛋白的高表達量、翻譯后修飾質量和遺傳穩定性是主要的標準。不同的表達系統具有各自的優缺點，需要根據產品的特性選擇合適的系統和宿主。優勢宿主的篩選是生產異源蛋白的關鍵步驟。在選擇優勢宿主時，通常采用高通量篩選技術，這種技術的出現徹底改變了宿主篩選技術領域，通過使用 96 深孔板或類似技術對多個批次實驗進行平行篩選，提高了宿主的篩選效率。最終選擇的宿主要在產品質量、滴度、特定生產率、工藝可行性、預期的電荷變體和糖基化配置、沒有或較少的聚集形成和克隆穩定性上滿足標準。

2、細胞培養

在選擇好最佳宿主后，下一個重要環節是細胞培養的開發。為了更好的控制和優化細胞培養過程，開發了各種新的技術和工具。通常，在宿主發酵生產蛋白藥物時，通過優化培養基、溫度、pH、接種量和生產動力學等參數來提高蛋白質的合成。生物量增長率是促進產品合成的關鍵因素，對于補料分批生產技術至關重要，某些醫藥公司將宿主細胞增長率保持在小于最大增長率的特定值，通過補料來控制宿主細胞以特定增長率生長。不過，近年來制藥行業越來越關注通過將分批生產轉變到連續生產來提高生物合成效率。

在發酵工具上，使用自動化控制的一次性生物反應器系統是當今生物制藥公司的一個新趨勢。與傳統的不銹鋼系統相比，一次性系統投資成本和操作成本更低，生產周期更短，靈活性更好，大大減少了污染的幾率。這些一次性生物反應器及其附件可從50L擴大到2000 L的規模。從細胞工程到細胞培養方法的創新開發，使得單克隆抗體的產量從50 mg·L-1提高到5~20 g·L-1。

3、重組蛋白藥物分離純化

通過優化好的細胞上游培養工藝，特定的表達系統會產生大量的重組藥物蛋白，其中還包含一些宿主本身的蛋白、核酸等雜質，這些雜質可能對人體產生不利的生物活性。因此，對藥品的純度要求非常嚴格，這就需要對產品蛋白進行精度純化。此環節是重組藥物蛋白制備技術的關鍵，是決定蛋白藥物品質的核心。單克隆抗體或任何其他蛋白（包括重組酶）一般是通過各種過濾步驟和色譜層析等技術進行純化的。色譜法是純化有價值產品最合適的技術，許多成熟的色譜方法已經應用到實際的生物制藥生產中。

細胞培養完成后，離心、大孔徑切向流過濾和深度過濾是用于初級細胞澄清的常用技術，深度過濾和生物減重過濾器有助于二次澄清過程。不同的表達系統可能會有不同的分泌部位，導致收集方式不同。如在大腸桿菌中表達的重組蛋白通常以包涵體的形式積累，需要回收后在體外重新折疊這些蛋白質，使其具有生物活性。

由于蛋白藥物混合物中含有大量不同化學性質的雜質，單一的色譜技術往往不足以獲得良好的分離。傳統的重組蛋白藥物純化工藝，是在收獲澄清后進行超濾濃縮，隨后進行逐級的單柱色譜分離純化，在充分了解目標蛋白和雜質的理化性質后，盡量減少純化步驟，一般分離純化不超過4步。隨著技術的發展，一種創新的固定相被開發出來，其結合了兩種分離機制（反相或HILIC和離子交換），形成一種混合模式的純化方式。考慮到蛋白藥物混合物通常需要結合基于多種不同分離原理的色譜技術來提高分辨率，從而產生多維色譜分離技術。在線多維色譜中，從第一根色譜柱流出的產物會立即注入第二根色譜柱，并加快分析時間。通常，在分離過程中，質譜與多維色譜聯用可提高純度。

近年來，為了處理復雜生物分子混合物的純化，又開發了一種稱為多柱逆流溶劑梯度純化（MCSGP）技術。MCSGP技術的原理是流動相相對于固定相逆流運動，通過一系列切換閥進行模擬，使整個過程實現循環和自動化。使用MCSGP 技術可以使目標蛋白和雜質之間的重疊峰在內部循環，以便再加工，并且可以使用溶劑梯度進行洗脫。這種技術已被用于多個需要加強純化的案例中，如單克隆抗體、寡核苷酸、大 麻二酚和多肽的純化。

4、重組蛋白藥物的藥效延長方法

重組蛋白藥物相較于一般藥物具有特殊性，目前，提高重組蛋白藥物效果的研究方法主要基于如下3 種原理產生，第一，提高藥物蛋白分子量，降低腎小球過濾；第二，借助游離型或者結合型藥物，維持血漿平衡，減緩藥物釋放；第三，降低異源蛋白免疫原，以有效降低藥物釋放率。基于以上3 種原理出現了以下延長藥效的方法。

①構建突變體：采用構建突變體延長藥物半衰期的方法主要如下：第一，提升藥物糖基化度，以此增加藥物表面側鏈，提升蛋白質平穩度，防止蛋白酶快速降解藥物；第二，提高藥物分子量，避免腎小球過濾，延長游離型藥物作用時間。基于上述兩種方法目前存在下述研究：第一，重組人促紅細胞生成素（EPO）存在1個O與3個N 糖基化位點。O是否糖基化與人體活性關系以及清除速度關系不大，但是N如果不完全重組則會影響人體活性，會導致體內活性降低。即是說，N 糖基化更為重要，它能夠維持活性同時降低清除率。第二，研究基于大腸桿菌的K12株發現，基于人胰島素A-21位點下的反應Asp 變為了Gly，在B-30位點下的反應使得 PI-pH4.0變為了pH6.7。該突變能夠形成澄清溶液，進入人體后鑒于其電解特點，可以轉化成難溶物質，并持續釋放，溶于血液，長時間保持平穩，沒有尖峰，由原來的4-8h藥效延長至24h以上，由每日3次的給藥變為每日1次。

②PEG 化修飾：聚乙二醇共價修飾蛋白質即為 PEG 化修飾。采取提升蛋白質分子量的方式降低藥效流失，將 PEG 作為屏障隔離蛋白質分子表面反應，降低免疫原性，降低藥物流失速度，同時保護蛋白質不被水解。PEG 的上述作用可以大大提升藥物抗衰期時間。目前，存在兩代 PEG 修飾法，一是借助分子量不足 12kDa 的分子；二是借助分支PEG 替代 PEG，提升偶聯分子量，同時增加其數量，使其達到 60kDa。相較于一代，二代方法還能夠避免蛋白質被酶水解，同時屏蔽效應更大，同時降低清除率，是延長藥效的有效方法。

③血清白蛋白融合：人體中的血清白蛋白，簡稱 HSA，其內含 585 氨基酸球形蛋白質，分子量為 65kDa，屬于人體中高血漿含量蛋白質。HSA 是諸多內外源物質載體，藥物與 HSA 結合后，能夠降低生物利用度，并在同一時間增加半衰期。臨床諸多治療蛋白藥物以及多肽藥效均較短，但是 HSA 理論上最長能夠將其提升到 19d，同時由于 HSA 基因還能夠高效表達，雜質少，因此屬于延長藥效的重要方法。

目前，大量用于治療多種人類疾病的重組蛋白藥物，已獲批準并上市。經過幾十年的技術發展，我國重組蛋白藥物也取得了很大的進步，尤其是近兩年新冠疫 苗的研發上。隨著分子和細胞技術的不斷發展，重組蛋白藥物的產量和質量也有了很大的提高，加工周期大幅縮短。隨著基因編輯技術的發展，特別是 CRISPR/Cas9 等新型技術的應用，載體工程取得新的突破，未來越來越多特定改造的細胞系將被用于重組蛋白藥物的生產。此外，進一步提高國內重組蛋白藥物的長效性，推動相關標準的升級和創新，促進長效性蛋白藥物的開發，也是我國生物醫藥的研究重點。

參考資料
[1]周娜娜,王小艷,張媛,王靖,趙國淼,魏超,楊凱,安泰.重組蛋白藥物的生產技術進展[J].生物技術進展,2021,11(06):724-731.DOI:10.19586/j.2095-2341.2021.0130.
[2]李學琴. 長效重組蛋白藥物的研究進展[J]. 健康之友,2020(14):291,290.

作者簡介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學碩士，現就職于國內某大型藥物研發公司，從事營養食品的開發與研究。