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采用培養基代替藥品進行無菌工藝模擬試驗，是無菌生產工藝的一種必要方式。為了確保無菌產品的無菌性，文章對凍干產品無菌工藝模擬試驗方案的實施進行闡述，介紹了該方案的準備條件，灌裝、凍干和軋蓋過程，過程取樣以及環境監控等，對方案進行部分改進，優化了方案內容，并對無菌工藝模擬試驗的結果進行分析，結合實例探討了西林瓶生產線凍干產品培養基試驗的策略，以提高非最終滅菌產品的無菌保障水平。

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引言

無菌工藝模擬試驗是指采用微生物培養基替代無菌產品，對整個無菌生產工藝進行評估驗證的技術，通常也被稱為“培養基灌裝試驗”。需要把培養基灌裝于無菌容器中，并在無菌生產環境中進行轉運，通過模擬此無菌工藝的過程，最后將灌封有培養基的容器在適當溫度下進行培養，檢查容器內微生物的生長狀況，來對無菌工藝模擬試驗的結果進行評價，評價該試驗是否在操作過程中產生了污染。通常將此試驗應用于非最終滅菌的無菌產品中，而對最終滅菌產品沒有強制的要求。

根據《藥品生產質量管理規范（2010 年修訂）》（Good Manufacturing Practice of Medical Products，GMP）以及附錄1的“無菌要求”，無菌產品的生產應當進行培養基灌裝試驗。在無菌生產過程當中，對于直接接觸藥物的設備、部件、灌裝容器以及原料，雖然已經過滅菌，但是當采用這些要素進行無菌生產時，仍然會由于各種因素導致產品發生污染，從而影響了無菌產品的質量。因此，無菌工藝的評估應當采用一種更合適的方式進行。無菌工藝模擬試驗，是對無菌工藝進行評估的一種驗證技術，采用培養基模擬完成實際無菌生產操作后，可以對結果進行評價，借以確定實際生產中產品被污染的概率。

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2
無菌工藝模擬試驗方案技術要求

廣西梧州制藥（集團）股份有限公司生產的無菌產品為凍干制劑，故以凍干產品的無菌工藝模擬試驗來模擬整個工藝過程，包括從部件、材料的滅菌準備，一直到完成灌裝和軋蓋等整個過程。

而對于無菌工藝模擬試驗方案的設計中，工藝條件的選擇應當選取合理的“最差條件”，即整個工藝流程，應采用最差條件來進行試驗。最差條件即在工藝規程允許范圍內，正常生產會遇到的最差情況，其并不包括由偏差引起的超出工藝要求的特殊情形。如果在最差條件下培養基灌裝試驗仍然取得好的結果，那么說明在比最差條件還要好的正常實際生產過程中，無菌保證水平會更有保證。

2.1
無菌工藝模擬試驗最差條件設計

凍干產品的無菌工藝模擬試驗最差條件設計，可以包括在準備階段將物料、灌裝器具、設備等按照工藝要求在無菌條件下放置允許的最長時間；灌裝時可以在關鍵區域保留最多的人員；模擬在工藝允許范圍內更長的灌裝時間；控制無菌工藝模擬試驗灌裝速度等。

2.2
最差條件具體實施方式

2.2.1 控制物料、器具、設備等放置時間
凍干工藝所采用的西林瓶、膠塞、鋁蓋、灌裝器具、配料系統和凍干柜，將其滅菌并放置工藝規程允許的最長時間后使用，如表1所示。

表1 包材、器具與設備滅菌后放置時間記錄表

其中，為了考察其放置最長時間后的無菌水平，西林瓶、膠塞和鋁蓋在放置結束后，均取樣進行了無菌性檢查，結果均符合無菌工藝要求，可繼續用于無菌工藝模擬試驗。

2.2.2 控制灌裝人數

參與無菌工藝模擬試驗的關鍵區域人員，均按表2所示進行人員控制。進行無菌工藝模擬試驗時，實際操作人員數量均按工藝規程允許的最大人員數量進行。其中，各潔凈室組成人員，可由操作工、維修人員和檢測人員組成，操作人員負責無菌模擬試驗的生產操作，檢測人員負責微生物取樣、環境監控等操作，維修人員負責對設備進行模擬維修或突發情況的處理。

表2 培養基灌裝試驗人員控制記錄表

2.2.3 灌裝速度與時間控制

在灌裝運行速度上，基于風險評估，應對灌裝速度進行評估并說明所定速度的理由。一般來說，對于廣口的容器，可采用在無菌生產區暴露較長時間的工藝，即降低灌裝速度，考察無菌過程是否受到污染；而對于瓶口較小的容器，可采用高速運行的方式來評估，在高速運行中進行大量手工操作干擾，用于評估無菌生產工藝是否受到污染。

培養基灌裝的持續時間控制是方案設計時必須考慮的重要問題，綜合考慮生產操作、操作干擾和實際無菌操作的周期后，盡管最準確的方法是模擬全批量的操作時間，因為其最能反映實際生產運行的情況，但也可以有其他合理且適當的模式，預估模擬試驗的時間一般不少于正常實際操作生產的時間，以更好地反映整個過程所帶來污染的風險。

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試驗先決條件檢查

3.1
廠房設施設備以及公用系統的準備

廠房設施設備以及公用系統的準備具體內容如下[1]。進行凍干產品無菌工藝模擬試驗，需要確認工藝設備、公用系統和輔助設施都已經按照預期進行了相應的驗證，且物品、廠房和設施所使用的消毒劑和消毒方式也完成了相應的驗證。

對于藥液及產品所接觸到的氣體、設備組件、容器、器具滅菌工藝都應完成相應的驗證，無菌生產區域的環境，應達到設計要求，能夠持續穩定地運行。

3.2
人員的培訓

參與無菌工藝模擬試驗的人員，應接受藥品GMP、無菌操作、微生物知識以及實施無菌模擬試驗的相關培訓，且進入無菌潔凈區的全部人員，都應通過無菌更衣程序的確認，確認每位參與者可進入的區域以及其所允許的無菌操作項目。

3.3
培養基及相關包材的準備

進行無菌工藝模擬試驗，應充分考慮模擬介質與無菌工藝的適宜性，應結合被模擬產品的特點以及模擬介質的可過濾性、澄清度、滅菌方式等方面來選擇培養基，盡可能地模擬無菌生產工藝流程，且不應該選擇具有抑菌性的模擬介質，以確認模擬試驗的可信度。通常可以采用的培養基為胰酪胨大豆肉湯（Tryptic Soytone Broth，TSB），其無抑菌作用，且滅菌方式簡單易操作；易溶解和擴散（若溶解性不好，懸浮在培養基中的模擬介質使培養基發生渾濁，容易影響結果的判斷）；易清潔，對設備沒有腐蝕性，對人體無害，不會對環境造成污染。培養基在使用前已進行除菌過濾，其滅菌方式應經過驗證。

無菌工藝模擬試驗所用到的包裝材料，應按相關質量標準檢驗合格，具備檢驗合格報告單。

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無菌工藝模擬試驗方案的實施

4.1
檢測儀器與設備

ApexZ50 激光塵埃粒子計數器、MAS-100NT浮游菌采樣儀。

4.2
材料與試劑

TSB 培養基、TSA 培養基、培養皿（55 mm、90 mm）、西林瓶（7 mL）、膠塞、鋁蓋。
4.3
無菌工藝模擬試驗實施過程

凍干產品的無菌工藝模擬試驗模擬的是整個工藝過程，包括培養基準備過程、灌裝過程、凍干過程、軋蓋過程和培養基微生物的培養過程，應在與實際生產相同條件下盡量模擬實際生產完成的相應操作，還應充分考慮生產時可能造成污染的各種因素，對各種干擾活動進行模擬，模擬無菌灌裝期間遇到的最差狀況下的操作。

4.3.1 培養基準備過程

試驗所使用的培養基應是經過微生物促生長能力檢測合格的培養基，培養基（TSB）配制完成后，經除菌過濾至無菌儲罐中，并在無菌儲罐中貯存工藝允許的最長時間，貯存結束后，進行下一步的模擬灌裝試驗。

4.3.2 灌裝過程

灌裝前，應按正常生產操作進行灌裝部件的組裝，并進行裝量的調節。由于培養基灌裝量較大（約9萬支），且為瓶口較小的7 mL 西林瓶，故采用高速灌裝，并在灌裝過程中穿插干擾操作的模式來進行模擬，根據洗烘灌聯動線的整體性能，把灌裝速度控制在350 支/min，灌裝第2 h 和第4 h，分別模擬一次灌裝干擾操作，綜合考慮生產操作、各種干擾和實際無菌操作的周期后，決定總灌裝時長約為6 h。

4.3.3 灌裝干擾操作實施與改進

在無菌工藝模擬試驗過程中，必須模擬所有正常操作的活動，包括取樣、稱重、沉降菌換皿、層流車轉運和產品出入凍干柜等，而除了這些計劃的活動以外，還存在非計劃卻不可避免發生的活動，比如西林瓶倒瓶、爆瓶的處理，灌裝異常的處理，各種灌裝機故障維修等，因此本次無菌工藝模擬試驗在進行所有正常操作的活動外，通過改進方案，需進行非正常的突發事件的處理來模擬最差生產狀況[2]。表3 可以作為本次無菌模擬試驗干擾項目和頻次的參考。

4.3.4 凍干過程

灌裝完的西林瓶運送至凍干柜內，關閉凍干柜門后，放置10 h 后，模擬抽真空補氣操作2 次（每次抽真空至500～600 mbar），引發柜內空氣流動，再通過無菌空氣達到氣流平衡。

4.3.5 軋蓋過程

凍干結束后，打開柜門擺放至少2 h，西林瓶出柜，放置密閉車至少6 h，然后進行軋蓋，軋蓋完成后，所有培養基產品全部制備完畢。

4.3.6 目檢過程

軋蓋后的產品轉移至目檢操作間，人工進行目檢檢查。

4.3.7 微生物的培養

已灌裝的培養基應當在適當的條件下進行培養，以檢出微生物，且培養溫度應適宜于一般微生物及環境分離菌的恢復生長。

（1）陰性對照。在模擬灌裝過程中，抽取16支灌裝并半加塞的培養基，進行壓塞密封，作為陰性對照品，其中8 支于30 ℃～35 ℃條件下培養14 天，另8 支于20 ℃～25 ℃條件下培養14 天，其陰性對照不應出現渾濁。

（2）陽性對照。為了確認培養基的促菌生長能力，在模擬灌裝試驗中，抽取25 支灌裝后半加塞的培養基，壓塞密封，作為陽性對照品，其中5 支接種金黃色葡萄球菌混懸液，5 支接種銅綠假單胞菌混懸液，5 支接種枯草桿菌混懸液，5 支接種白色念珠菌混懸液，5 支接種黑曲霉懸浮液，各菌種混懸液均為0.1 mL，濃度＜100 cfu/0.1 mL。接種后，按藥典規定進行菌種的培養。培養結束后，觀察陽性對照品的生長情況，應被證實有菌生長則為合格。

（3）試驗樣品的培養及調查。無菌工藝模擬試驗的全部樣品應當在適宜的溫度條件下培養14 天，先于較低溫度（20 ℃～25 ℃）下培養至少7 天，然后在較高溫度（30 ℃～35 ℃）下培養至少7 天，在低溫和高溫的培養過程中和培養結束后，分別觀察一次，并記錄檢查結果，若發現污染應明確記錄樣品數量，若出現破損應記錄并檢查破損原因。

由于灌裝數量超過10 000 支，若出現1 支污染，需進行調查；出現2 支污染，需調查后進行再驗證。培養基灌裝的標準允許少量污染瓶的存在，但這絕對不是允許投放市場的
無菌產品中可以存在受污染的狀況，無菌工藝的目的就是防止污染，發現任何污染樣品均應進行調查，分離到的污染微生物更應鑒別到種。若培養基灌裝反復出現污染，即使每次都符合標準，也必須采取更嚴格的防污染措施[3]。

4.3.8 過程取樣及環境監控

無菌工藝模擬試驗過程中，需對過程中的無菌包材進行取樣，并對環境進行監控，以考察生產操作的實際情況，不應采取特別的生產控制和預防措施，制造特別良好的工藝環境，這樣會導致不準確的評估結論，造成工藝條件良好的假想，過程取樣及環境監控如表4 所示。

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結束語

本文詳細描述了凍干產品無菌工藝模擬試驗的改進和實施。因不同的產品劑型，如懸浮液的無菌灌裝、無菌粉末產品、無菌霜劑、無菌乳膏劑等，工藝會有一些差異，灌裝過程中的干預方式、操作方式等在方案的設計上會有細節的不同，需要技術人員根據不同的劑型進行方案設計，并完整記錄整個過程，在培養結果發生異常時，灌裝過程的記錄會成為基礎的調查證據。隨著法律法規的不斷完善，制藥工藝的不斷優化和制藥工業企業的不斷發展，無菌工藝模擬試驗方案的設計將會愈加完善。

參考文獻
[1] 侯海濤，錢芳. 凍干粉針劑無菌工藝模擬試驗研究[J]. 科學與財富，2015，7(8): 173-174.
[2] 陳華美，黃渝，王大平. 培養基模擬灌裝試驗方法探討[J].山東化工，2015，44(8): 88-90.
[3] 國家食品藥品監督管理局藥品認證管理中心. 藥品GMP指南: 無菌藥品[M]. 北京: 中國醫藥科技出版社，2011.