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技術(shù)裝備
“溶劑效應(yīng)”產(chǎn)生的原因及解決方法
發(fā)布時(shí)間: 2025-02-26     來源: 制藥質(zhì)量、研發(fā)、注冊(cè)交流

 

在液相系統(tǒng)分析過程中,有沒有遇到過色譜峰前延現(xiàn)象?為什么有時(shí)候同一個(gè)樣品減小進(jìn)樣量色譜峰就變的很好看?日常的分析工作中,我們通常將更多精力集中在流動(dòng)相和儀器方法的選擇上,忽視了樣品進(jìn)樣溶劑的重要性。

 


如果溶劑選擇不當(dāng)則會(huì)產(chǎn)生“溶劑效應(yīng)”,使我們?cè)诙ㄐ院投糠治鲋挟a(chǎn)生誤判,影響分析結(jié)果。因此,了解“溶劑效應(yīng)”產(chǎn)生的原因及掌握避免“溶劑效應(yīng)”的基本方法對(duì)我們分析工作者是十分必要的。今天小編就跟大家分享一下,液相分析過程中“溶劑效應(yīng)”的那些事兒~

 

PART 01

溶劑效應(yīng)是怎么回事兒


>>>1.溶劑效應(yīng)的概念

 

通常情況下對(duì)于溶劑效應(yīng)理解為稀釋劑溶劑強(qiáng)度大于流動(dòng)相時(shí)造成色譜峰變形的現(xiàn)象。如用純乙腈溶解樣品,注入流動(dòng)相為乙腈-水(18:82)的反相系統(tǒng)中,會(huì)造成峰分叉或拖尾的結(jié)果。但是這種概念不能解釋實(shí)踐中其他由稀釋劑導(dǎo)致的色譜行為異常現(xiàn)象,如溶出曲線研究中pH6.8溶出介質(zhì)的溶出樣品主峰峰型異常、或加入SDS助溶后峰分叉等情況,這些情況中稀釋劑的溶劑強(qiáng)度并不一定大于流動(dòng)相,但是卻發(fā)生了色譜行為異常的現(xiàn)象。

鑒于許多由稀釋劑導(dǎo)致的色譜行為異常現(xiàn)象不能用目前的溶劑效應(yīng)進(jìn)行解釋,筆者認(rèn)為有必要將溶劑效應(yīng)的概念進(jìn)行重新闡述:溶劑效應(yīng),是指由于供試品中特定組分在稀釋劑與流動(dòng)相中所處狀態(tài)的差異對(duì)色譜行為的不利影響。如果這種不利影響較為嚴(yán)重,則可能造成明顯的色譜行為異常,如峰分叉、拖尾等。

 

>>>2.溶劑效應(yīng)的產(chǎn)生過程解析

 


第一階段:樣品剛被注入系統(tǒng),進(jìn)入色譜柱后,流動(dòng)相氛圍中的目標(biāo)物以正常速度被洗脫。因強(qiáng)溶劑洗脫,移動(dòng)速度快,樣品在空間上開始慢慢分裂。

第二階段:在一定時(shí)間內(nèi),溶劑氛圍中的目標(biāo)物移動(dòng)始終快一些,前后兩部分距離擴(kuò)大。但移動(dòng)快的目標(biāo)物所處氛圍逐漸被流動(dòng)相稀釋(注:因?yàn)槿軇┖土鲃?dòng)相均不保留),其移動(dòng)速度會(huì)逐漸降至正常流速。直到前面目標(biāo)物的氛圍完全被流動(dòng)相替代,前后兩部分的距離穩(wěn)定下來。因而,樣品溶劑與流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度差距越大,兩部分目標(biāo)物最終的距離拉的越大。

第三階段:所有目標(biāo)物在色譜柱中正常移動(dòng),但分裂已不可逆轉(zhuǎn)。

經(jīng)過檢測(cè)器,同一目標(biāo)物給出了兩個(gè)色譜峰。其中進(jìn)柱前即擴(kuò)散進(jìn)入流動(dòng)相的那部分目標(biāo)物組成了后面的色譜峰,它的保留時(shí)間與目標(biāo)物的真實(shí)保留時(shí)間基本吻合。

簡(jiǎn)單概括,強(qiáng)洗脫溶劑不均衡地參與了目標(biāo)物的洗脫,使色譜峰保留時(shí)間整體提前,而樣品在柱前的不充分?jǐn)U散導(dǎo)致了峰形扭曲。這種影響輕則導(dǎo)致峰展寬,嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致峰裂分,給定性定量帶來災(zāi)難。

 

PART 02

溶劑效應(yīng)為啥會(huì)發(fā)生!

>>>1.溶劑強(qiáng)度

 


在反相色譜系統(tǒng)中溶劑強(qiáng)度的順序?yàn)樗ㄗ钊酰技状迹家译妫家掖迹妓臍溥秽急迹级燃淄椋ㄗ顝?qiáng))。溶解樣品的溶劑強(qiáng)度大于該樣品出峰時(shí)流動(dòng)相強(qiáng)度,樣品溶劑可以看成流動(dòng)相的一部分,一部分樣品溶解于溶劑中會(huì)被迅速洗脫出色譜柱,而一部分樣品溶解于流動(dòng)相,被流動(dòng)相洗脫出,這樣會(huì)造成色譜峰的展寬或者分叉。

 

>>>2.進(jìn)樣體積

 

當(dāng)進(jìn)樣體積較小時(shí),擴(kuò)散至流動(dòng)相中的溶質(zhì)占大多數(shù),且擴(kuò)散在很短時(shí)間內(nèi)完成,因此峰形與用流動(dòng)相直接溶解樣品無(wú)大差異。隨著進(jìn)樣的體積增大,留在溶劑本身里的溶質(zhì)的量逐漸增大,當(dāng)進(jìn)樣體積增大到一定數(shù)量,留在溶劑里的溶質(zhì)的量變得不可忽略,在色譜圖上就表現(xiàn)為色譜峰的分叉、拖尾等。

 

>>>3.溶劑與流動(dòng)相的兼容性

 

有時(shí),當(dāng)我們使用流動(dòng)相或流動(dòng)相中的有機(jī)相無(wú)法直接溶解樣品,這時(shí)很多小伙伴會(huì)選擇使用氯仿、甲苯等能溶的溶劑,甚至DMSO這樣的“萬(wàn)能溶劑”來溶解樣品。這樣進(jìn)樣的結(jié)果是溶劑與流動(dòng)相不兼容,溶質(zhì)難以在流動(dòng)相中擴(kuò)散。又如,在做參比制劑的溶出曲線中,溶媒中經(jīng)常加入表面活性劑。而帶有表面活性劑的溶劑進(jìn)樣后,由于溶質(zhì)在含有表面活性劑的溶劑中的分配系數(shù)與在流動(dòng)相中的分配系數(shù)存在較大差異,就會(huì)導(dǎo)致峰形的問題,甚至保留時(shí)間的漂移。

 

>>>4.電離狀態(tài)

 

電離狀態(tài)的差異主要由溶劑和流動(dòng)相各自的pH差異引起。我們都知道,在反相體系中,目標(biāo)化合物的存在狀態(tài)不同,保留行為會(huì)有明顯的差異,而存在狀態(tài)就取決于目標(biāo)化合物在不同pH體系內(nèi)的電離狀態(tài)。若樣品在溶劑和流動(dòng)相中電離狀態(tài)差異較大,樣品溶液在接觸流動(dòng)相的過程中,來不及緩沖至流動(dòng)相中的電離狀態(tài),這個(gè)時(shí)間如果較長(zhǎng),就容易表現(xiàn)為保留時(shí)間發(fā)生錯(cuò)位或峰形變形,如下圖的案例。

 

(流動(dòng)相為pH 3.0緩沖鹽。綠色譜圖為對(duì)照品,另外三個(gè)譜圖樣品的溶劑從下至上分別為0.1%磷酸、純化水、pH 3.0流動(dòng)相)

>>>5.柱前管路

 


柱前管路內(nèi)徑越大、管路越長(zhǎng),越利于目標(biāo)物向流動(dòng)相擴(kuò)散,而且使用更粗的管路比更長(zhǎng)的管路有效(注:假設(shè)死體積相同)。雖然粗的管路加劇了等度條件下的柱外展寬,對(duì)柱效有危害,然而相較于峰分叉的危害而言,前者尚能接受。

這就是為什么有時(shí)候會(huì)發(fā)現(xiàn),HPLC的液相(管路死體積大)比UPLC的液相(管路死體積小)色譜峰型好。


 

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