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質(zhì)粒工藝化生產(chǎn)流程包括逐級(jí)放大的菌體擴(kuò)增過(guò)程和下游純化過(guò)程，細(xì)胞與基因治療中最常用的載體AAV和慢病毒的生產(chǎn)都需要質(zhì)粒作為起始材料，因此每年需要大量符合質(zhì)量要求的質(zhì)粒來(lái)滿足下游細(xì)胞與基因治療的市場(chǎng)需求。

質(zhì)粒生產(chǎn)工藝中面臨的最大挑戰(zhàn)是大規(guī)模的生產(chǎn)放大和純化，即要維持高超螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的比例，又要保持高純度，以上兩點(diǎn)無(wú)論對(duì)于DNA疫苗還是對(duì)于下游病毒生產(chǎn)的效率與質(zhì)量 （如減少空殼率等）形成重大影響。

質(zhì)粒通常在大腸桿菌中發(fā)酵擴(kuò)增，提高大腸桿菌的生長(zhǎng)密度可擴(kuò)大質(zhì)粒的產(chǎn)量。但細(xì)菌密度增加會(huì)帶來(lái)溶氧不足的問(wèn)題，不僅會(huì)降低質(zhì)粒產(chǎn)量，還會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒質(zhì)量下降，具有超螺旋構(gòu)象的質(zhì)粒含量減少，給下游純化工藝帶來(lái)困難，也會(huì)間接提高生產(chǎn)成本。對(duì)大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中的溶氧量問(wèn)題進(jìn)行優(yōu)化后，可使質(zhì)粒產(chǎn)量提高1至50 倍。

大腸桿菌的裂解包含化學(xué)方法（堿、洗滌劑、酶、滲透沖擊）和物理方法（加熱、 剪切、攪拌、超聲波和凍融），其中堿性裂解是最常用的方法。堿裂解步驟中，pH 的控制和適當(dāng)有效的混合是關(guān)鍵，需要在狹窄的pH范圍內(nèi)使基因組DNA發(fā)生不可逆變性且質(zhì)粒雙鏈需要保持完整，大規(guī)模質(zhì)粒生產(chǎn)中，裂解過(guò)程往往工藝重復(fù)性差， 難以控制；該階段的質(zhì)粒對(duì)剪切力非常敏感，質(zhì)粒損失較大，超螺旋也容易丟失， 影響產(chǎn)量和質(zhì)量。

質(zhì)粒生產(chǎn)過(guò)程中常用層析法或色譜法進(jìn)行純化，不同開(kāi)發(fā)階段和使用級(jí)別對(duì)質(zhì)粒的質(zhì)量要求不同。質(zhì)粒純化的目的在于去除宿主DNA、RNA、蛋白和內(nèi)毒素以及非超螺旋的質(zhì)粒變體，以滿足針對(duì)目標(biāo)產(chǎn)品的使用要求，純化過(guò)程的優(yōu)化可提高質(zhì)粒產(chǎn)量、降低成本。質(zhì)粒作為細(xì)胞與基因治療藥品的生產(chǎn)原料，需要對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行鑒別，確保目的基因序列及整合無(wú)誤；作為關(guān)鍵原材料或終產(chǎn)品，需要對(duì)其功能進(jìn)行鑒定和控制；為保證安全性，對(duì)內(nèi)毒素、雜菌污染和支原體殘留的鑒別和檢測(cè)的周期往往約30天左右，決定著質(zhì)粒生產(chǎn)批次放行的周期；此外，質(zhì)粒因?yàn)闊o(wú)法終端滅菌，因此需要全程在封閉且獨(dú)立的生產(chǎn)車(chē)間進(jìn)行，且要避免交叉污染，因此自動(dòng)化、封閉式的系統(tǒng)是未來(lái)趨勢(shì)。

當(dāng)使用高拷貝數(shù)質(zhì)粒、采用優(yōu)化的發(fā)酵工藝可獲得約1-2g/L的質(zhì)粒，但目前行業(yè)內(nèi)絕大部分公司的質(zhì)粒產(chǎn)量不到0.5g/L，工藝優(yōu)化的空間還非常廣闊。質(zhì)粒由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且理化性質(zhì)相似，因此構(gòu)建一個(gè)平臺(tái)化的生產(chǎn)和純化工藝相對(duì)簡(jiǎn)單。質(zhì)粒生產(chǎn)周期較短，上游發(fā)酵和下游純化罐裝工藝約需6天，但質(zhì)粒的質(zhì)量控制約需30天（主要對(duì)支原體等檢測(cè)周期較長(zhǎng)），質(zhì)粒生產(chǎn)的年產(chǎn)能可達(dá)100批次。
綜上，質(zhì)粒生產(chǎn)的工藝優(yōu)化對(duì)于提升質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量具有極大的意義，在大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵、質(zhì)粒的提取和純化工藝上，目前仍然具有非常廣闊的優(yōu)化空間。

綜上，質(zhì)粒生產(chǎn)的工藝優(yōu)化對(duì)于提升質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量具有極大的意義，在大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵、質(zhì)粒的提取和純化工藝上，目前仍然具有非常廣闊的優(yōu)化空間。

病毒載體
高昂的生產(chǎn)成本是細(xì)胞
與基因治療商業(yè)化的痛點(diǎn)

AAV生產(chǎn)成本
其關(guān)鍵在于質(zhì)粒和細(xì)胞培養(yǎng)體系

HEK293細(xì)胞/三質(zhì)粒系統(tǒng)是AAV生產(chǎn)的主流系統(tǒng)：AAV生產(chǎn)系統(tǒng)包括HEK293細(xì)胞/三質(zhì)粒系統(tǒng)和依賴(lài)于昆蟲(chóng)桿狀病毒、腺病毒、單純皰疹病毒或痘病毒的包裝系統(tǒng)。以HEK293細(xì)胞/三質(zhì)粒系統(tǒng)和昆蟲(chóng)桿狀病毒系統(tǒng)最為常見(jiàn)，但由于昆蟲(chóng)桿狀病毒系統(tǒng)的單個(gè)細(xì)胞生產(chǎn)效率低、病毒活性低等特點(diǎn)，目前業(yè)內(nèi)最主流的還是采用HEK293 細(xì)胞/三質(zhì)粒生產(chǎn)系統(tǒng)。

AAV載體生產(chǎn)成本的控制較為關(guān)鍵。據(jù)Nature Reviews Drug Discovery披露，目前約有238個(gè)基于AAV的細(xì)胞與基因治療臨床試驗(yàn)正在開(kāi)展，是臨床試驗(yàn)中使用最多的病毒載體之一。AAV細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品價(jià)格高昂的主要原因在于其工業(yè)化生產(chǎn)的多個(gè)方面未得到全面優(yōu)化，如何降低成本、擴(kuò)大商業(yè)化生產(chǎn)能力是AAV基因治療產(chǎn)業(yè)化的最大難題。我們以AAV的生產(chǎn)工藝過(guò)程為基礎(chǔ)，分析AAV載體生產(chǎn)過(guò)程中的成本控制關(guān)鍵。

質(zhì)粒是AAV生產(chǎn)成本的主要來(lái)源：根據(jù)Polyplus公司披露，AAV載體生產(chǎn)過(guò)程中， 質(zhì)粒約占了生產(chǎn)成本的40-60%，除此以外，細(xì)胞和培養(yǎng)基以及血清約占生產(chǎn)成本的 20-30%。質(zhì)粒價(jià)格約為10-30萬(wàn)美元/g，質(zhì)粒用量大約為1μg/106個(gè)細(xì)胞。對(duì)于病毒載體生產(chǎn)，每升生物反應(yīng)器大約平均需要0.5mg質(zhì)粒DNA進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，各廠家依據(jù)所用轉(zhuǎn)染試劑的不同，每升生物反應(yīng)器的質(zhì)粒需求量也有所差異。因此優(yōu)化的質(zhì)粒生產(chǎn)工藝（提升產(chǎn)率與質(zhì)量）和減少下游質(zhì)粒的使用量（如開(kāi)發(fā)效率高的轉(zhuǎn) 染試劑）能大幅降低AAV載體生產(chǎn)成本。

懸浮培養(yǎng)是AAV生產(chǎn)的未來(lái)趨勢(shì)：AAV的規(guī)模化生產(chǎn)包括貼壁培養(yǎng)體系和懸浮培養(yǎng)體系。傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)工藝放大難、人力需求高且必須使用血清，達(dá)到的細(xì)胞密度低，因而產(chǎn)量更低；微載體或片狀載體培養(yǎng)系統(tǒng)在提高細(xì)胞產(chǎn)量的同時(shí)還能大大減少人力成本，但是最大的缺點(diǎn)在于高效轉(zhuǎn)染難；而懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能更大程度滿 足臨床規(guī)模生產(chǎn)，并且無(wú)血清懸浮培養(yǎng)能減少血清的使用，不僅能降低生產(chǎn)成本，還能簡(jiǎn)化下游純化技術(shù)（上游生產(chǎn)不需要添加血清）。然而，懸浮培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展的難點(diǎn)在于細(xì)胞易成團(tuán)并且馴化無(wú)血清懸浮細(xì)胞系的過(guò)程比較難，耗時(shí)長(zhǎng)。然而，基因治療方式從局部給藥拓展到系統(tǒng)性給藥過(guò)程中，基于AAV的基因治療藥物治療劑量也將指數(shù)級(jí)增加，成本也相應(yīng)的大幅提升，因此開(kāi)發(fā)生產(chǎn)成本更低的懸浮培養(yǎng)模式代表著未來(lái)發(fā)展方向。

目前大部分公司正在從貼壁培養(yǎng)技術(shù)過(guò)渡到懸浮培養(yǎng)技術(shù)，據(jù)CRB披露，約有65% 的公司正在建設(shè)或預(yù)計(jì)建設(shè)懸浮細(xì)胞病毒載體生產(chǎn)平臺(tái)。國(guó)內(nèi)宜明細(xì)胞的200L無(wú)血清AAV制備平臺(tái)采用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可制備包括rAAV2、rAAV5、rAAV8和rAAV9 等多種符合GMP的AAV血清型，病毒產(chǎn)量可高達(dá)1E14vg/L，細(xì)胞的密度可達(dá)1E7 cells/mL。

Pall公司Emmanuelle Cameau等人于2019年在Cell & Gene Therapy Insights上對(duì)不同培養(yǎng)體系下AAV生產(chǎn)成本進(jìn)行了拆分，懸浮培養(yǎng)體系單劑量的生產(chǎn)成本為 11953美元，相比細(xì)胞工廠的成本15152美金，降低了20%，質(zhì)粒DNA是生產(chǎn)成本的主要來(lái)源之一，成本占比約38%；采用Pall的iCELLis固定床生物反應(yīng)器，能提高細(xì)胞濃度和轉(zhuǎn)染效率，大大減少質(zhì)粒用量，因此進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本，單個(gè)劑量的AAV生產(chǎn)成本僅7723美金至9654美金，質(zhì)粒成本占比降低至20%以下。綜上，對(duì)培養(yǎng)體系的優(yōu)化對(duì)于AAV生產(chǎn)成本的降低至關(guān)重要，培養(yǎng)體系的優(yōu)化方向主要在于增加細(xì)胞培養(yǎng)密度、減少質(zhì)粒用量并提高轉(zhuǎn)染效率。

高質(zhì)量的轉(zhuǎn)染試劑是AAV生產(chǎn)的核心要素，決定了質(zhì)粒用量、病毒得率和純度：轉(zhuǎn)染試劑在很大程度上決定了質(zhì)粒的用量、病毒得率和純度。大規(guī)模生產(chǎn)上常用的轉(zhuǎn)染方式有兩種，磷酸鈣轉(zhuǎn)染法和PEI轉(zhuǎn)染法（聚乙烯亞胺），賽默飛的LIPO 2000（一 種脂質(zhì)體）轉(zhuǎn)染效率最高，然而價(jià)格昂貴，大規(guī)模生產(chǎn)中使用較少。磷酸鈣轉(zhuǎn)染的 優(yōu)點(diǎn)為價(jià)格便宜，但缺點(diǎn)為效率非常低，并且誤差很大，很難達(dá)到工藝的一致性， 因此難以用于臨床級(jí)病毒載體的生產(chǎn)。目前主流的方式為PEI轉(zhuǎn)染法，PEI為陽(yáng)離子聚合物，可以與帶有負(fù)電荷的核酸結(jié)合從而形成復(fù)合體通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞中， 成本相對(duì)較適中。

PEI決定了達(dá)到高轉(zhuǎn)染效率時(shí)所需的質(zhì)粒用量。據(jù)轉(zhuǎn)染試劑供應(yīng)商Polyplus數(shù)據(jù)顯示，PEI轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞時(shí)所需質(zhì)粒用量約為1~2.5 μg/106個(gè)細(xì)胞，這決定了病毒生產(chǎn)時(shí)需要大量的質(zhì)粒。因此對(duì)于PEI的優(yōu)化可以減少質(zhì)粒用量、提供病毒生產(chǎn)效率，從而降低成本。Polyplus的FectoVIR-AAV轉(zhuǎn)染體系使用PEI轉(zhuǎn)染后，使病毒生產(chǎn)中的空殼率有效降低，病毒產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)提升2至10倍，并且病毒的感染能力也大大提升，同時(shí)質(zhì)粒的用量能減少1/3，使得單個(gè)批次的生產(chǎn)成本得到大幅降低。

AAV生產(chǎn)下游工藝復(fù)雜，整體回收率低：AAV病毒載體生產(chǎn)的下游工藝包括細(xì)胞裂解、澄清、核酸酶處理、超濾、色譜柱純化、超濾濃縮、除菌過(guò)濾及罐裝等，涉及的工藝復(fù)雜。由于AAV常用于在體的基因治療，因此對(duì)純度和濃度的要求都非常高。

下游需要有較強(qiáng)的純化能力，用于去除工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，特別是空殼病毒。工藝相關(guān)雜質(zhì)如細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)基組分等的去除相對(duì)容易，可采用核酸酶、超濾和親和層析的方式去除；而產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)如空殼病毒、聚集體和降解產(chǎn)物等較難去除，特別是空殼病毒，其在患者體內(nèi)不僅會(huì)競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面有限的受體，而且還有引起過(guò)度免疫反應(yīng)的隱患。由于當(dāng)將它們輸注給患者時(shí)，一方面會(huì)競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面有限的受體數(shù)量；另一方面對(duì)基因治療無(wú)益處，還有可能引起副反應(yīng)。由于空殼病毒和完整病毒僅等電點(diǎn)存在細(xì)微差異，因此分離困難，通過(guò)高分辨率陰離子交換樹(shù)脂可以降低空殼比。

為了得到最佳收率和分離效率，不同的AAV血清型需要設(shè)計(jì)不同的層析方案。原因在于AAV血清型與陰離子交換填充的結(jié)合特性不同，Benjamin Adams等在 Biotechnology Bioengineering對(duì)AAV的精制層析進(jìn)行了研究，指出AAV5需要在偏酸性條件下才能有效地與陰離子交換填料結(jié)合，而AAV8則在偏堿性條件下最佳。所以工藝上難以針對(duì)AAV設(shè)計(jì)一個(gè)平臺(tái)化的通用純化方法，從而增加了生產(chǎn)成本。

為了達(dá)到治療所用的AAV濃度，原液產(chǎn)物通常需要濃縮100倍至10000倍，下游純化 也會(huì)有部分損失，因此對(duì)GMP設(shè)備提出了較大的挑戰(zhàn)。上游工藝獲得的病毒約為 1E4-5E5vg/細(xì)胞的載體滴度，粗收獲液中的單位體積滴度約為1E10-2E11vg/mL， 而AAV的臨床給藥范圍通常為1E12vg/kg/mL-1E14vg/kg/mL，因此產(chǎn)物需要濃縮達(dá)100倍至10000倍。AAV的下游整體回收率僅30-40%，還存在很大的優(yōu)化空間，提升下游回收率可大幅增加產(chǎn)量，控制生產(chǎn)成本。

系統(tǒng)性給藥方式對(duì)AAV的需求量增加，成本更會(huì)成為商業(yè)化的一大痛點(diǎn)。根據(jù)Nature Reviews Drug Discovery的數(shù)據(jù)顯示，從局部眼睛的用藥到肌肉、血液等大范圍、 系統(tǒng)性的用藥，其所需病毒載量呈現(xiàn)10至10000倍增長(zhǎng)，局部給藥與系統(tǒng)給藥劑量具有數(shù)量級(jí)的差異。從支付端來(lái)說(shuō)，直接導(dǎo)致了大范圍系統(tǒng)性給藥的價(jià)格的大幅提高，例如針對(duì)眼部疾病的Luxturna售價(jià)為85萬(wàn)美金，而肌肉給藥的Zolgensma售價(jià)達(dá)210萬(wàn)美金；從成本端來(lái)說(shuō)，未來(lái)針對(duì)系統(tǒng)性給藥的治療方式，成本和難以滿足的需求更會(huì)成為商業(yè)化的一大痛點(diǎn)。

總的來(lái)說(shuō)，作為目前臨床試驗(yàn)使用最多的病毒載體，AAV的生產(chǎn)成本控制至關(guān)重要， 不僅能降低上游CDMO企業(yè)的成本，還能使終端產(chǎn)品價(jià)格降低，提升病人用藥的可及性。AAV基因治療產(chǎn)品高昂成本的降低可以從優(yōu)化培養(yǎng)體系、提高質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率、 提升下游回收工藝和構(gòu)建通用的AAV純化平臺(tái)等方面入手，注重布局以上工藝體系 的細(xì)胞與基因治療CDMO企業(yè)，必將在行業(yè)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

慢病毒載體
其純化生產(chǎn)工藝中的最大瓶頸

慢病毒載體能整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組和不具有組織特異性的特點(diǎn)，使慢病毒載體被廣泛用于體外細(xì)胞基因治療中。CAR-T、UCAR-T、CAR-NK和干細(xì)胞產(chǎn)品主要使用慢病毒載體。目前常用的第三代慢病毒載體系統(tǒng)由四質(zhì)粒構(gòu)成，其中三個(gè)質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)粒，另一個(gè)包含目的基因的載體質(zhì)粒為個(gè)性化的質(zhì)粒，同AAV一樣，質(zhì)粒也是慢病毒載體生產(chǎn)的一個(gè)重要成本來(lái)源。第三代載體系統(tǒng)增加了兩個(gè)安全特性， 一是構(gòu)建自失活的慢病毒載體，二是用異源啟動(dòng)子序列代替Tat基因，更加安全。

懸浮無(wú)血清培養(yǎng)逐漸替代貼壁培養(yǎng)體系：慢病毒的懸浮無(wú)血清培養(yǎng)已逐步替代傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)模式，慢病毒貼壁培養(yǎng)的制備需要使用大量進(jìn)口血清，而這些進(jìn)口血清價(jià)格高昂，是成本中不可忽略的因素，慢病毒懸浮無(wú)血清培養(yǎng)可以極大地降低生產(chǎn)成本。另外，貼壁培養(yǎng)中，Cell stack替代細(xì)胞工廠也是一個(gè)趨勢(shì)。

慢病毒載體理化性質(zhì)不穩(wěn)定，活性易喪失，回收率低，下游純化工藝是關(guān)鍵：慢病毒載體的上游工藝難以產(chǎn)生差異化，最大的挑戰(zhàn)在于慢病毒載體的純化過(guò)程。慢病毒載體由于具有包膜結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)不穩(wěn)定，對(duì)剪切力敏感，因此下游工藝中的回收率較低，通常只有10%左右，優(yōu)化后的回收率大概為30-40%，滴度大約為106 -108TU/mL，因此對(duì)下游純化工藝的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化是慢病毒規(guī)模化生產(chǎn)的瓶頸和關(guān)鍵。

慢病毒載體生產(chǎn)成本測(cè)算：根據(jù) Ruxandra-Maria Comisel 等 在 Biochemical Engineering Journal中對(duì)五種不同細(xì)胞培養(yǎng)體系下慢病毒載體的生產(chǎn)成本（GOG） 進(jìn)行了測(cè)算（基于模型假設(shè)），并且基于此對(duì)慢病毒載體的生產(chǎn)成本進(jìn)行拆分，細(xì)胞培養(yǎng)體系為10層細(xì)胞工廠（CF10）、中空纖維生物反應(yīng)器（HF）、固定床生物反應(yīng)器（FB）、微載體搖擺式生物反應(yīng)器（RMmc）和懸浮培養(yǎng)下的一次性攪拌槽式生物反應(yīng)器（SUB（STR））。

不同培養(yǎng)體系下成本測(cè)算：SUB、RM和FB可獲得最大程度的規(guī)模效應(yīng)，隨著規(guī)模放大到生產(chǎn)10,000劑量，每劑量的慢病毒生產(chǎn)成本可低至1200美金；CF10和HF難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化效應(yīng)，每劑量的生產(chǎn)成本分別約38000美金和9300美金。因此，懸浮培養(yǎng)、固定床生物反應(yīng)器和微載體對(duì)于規(guī)模化生產(chǎn)慢病毒載體最為經(jīng)濟(jì)，可有效降低生產(chǎn)成本。

慢病毒生產(chǎn)成本拆分：假設(shè)慢病毒的年產(chǎn)量為1000劑/年，HF和CF10的上游一次性耗材的成本占比達(dá)82%和34%，是生產(chǎn)成本的主要來(lái)源；而在規(guī)模化培養(yǎng)體系如 RMmc600、SUB500和FB333下，質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑花費(fèi)是生產(chǎn)成本的主要來(lái)源，占比約46%、41%和36%。綜上，慢病毒載體生產(chǎn)成本主要來(lái)自上游一次性耗材和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體系，發(fā)展規(guī)模化生產(chǎn)、開(kāi)發(fā)不依賴(lài)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)體系是降低成本的關(guān)鍵所在。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體
生產(chǎn)技術(shù)門(mén)檻高，成本相對(duì)更低，轉(zhuǎn)染效率更高

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生產(chǎn)技術(shù)門(mén)檻高，需要一定的技術(shù)積累，但其發(fā)展比較早，因此工藝生產(chǎn)相對(duì)更加完善。逆轉(zhuǎn)錄病毒能通過(guò)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行生產(chǎn)，因此產(chǎn)品質(zhì)量相比 慢病毒載體更加穩(wěn)定，工藝放大容易，單個(gè)批次生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可供500名病人進(jìn)行細(xì)胞治療。Kite和Brammer公司均采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)進(jìn)行基因治療研 究，Kite的Yescarta以PG13-CD19-H3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系為起始物料。

逆轉(zhuǎn)錄病毒的成本更低：相比于慢病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的成本低10倍以上。Novartis的Kymriah采用慢病毒載體進(jìn)行制備，定價(jià)為47.5萬(wàn)美元，Kite的Yescarta 采用逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行制備，定價(jià)為37.3萬(wàn)美元，相較于Kymriah降低了約21.5%。原因在于慢病毒載體的生產(chǎn)需要毫克級(jí)別的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，而逆轉(zhuǎn)錄病毒載體僅需微克級(jí)別的質(zhì)粒，在大規(guī)模生產(chǎn)上大大節(jié)約了成本。

逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染效率更高：逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染效率高，應(yīng)用于細(xì)胞治療時(shí)相對(duì)于慢病毒來(lái)說(shuō)，CAR的陽(yáng)性率也更高，因此盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)工藝門(mén)檻高，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)的應(yīng)用和效益來(lái)看，逆病毒載體仍然具有很大的優(yōu)勢(shì)。

逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入毒性是其臨床應(yīng)用發(fā)展的障礙。早期的體外細(xì)胞與基因治療多采用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒作為遞送載體，直到在治療一項(xiàng)X連鎖的重癥聯(lián)合免疫缺陷病的臨床試驗(yàn)中，γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒在9位受試者中造成了4位受試者發(fā)生了T淋巴細(xì)胞白血病的嚴(yán)重副反應(yīng)，γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒的安全性再次受到質(zhì)疑，慢病毒載體的臨床使用逐漸增多。盡管兩種載體都能插入到基因組中，但γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體更傾向于整合到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近，更容易具有致癌風(fēng)險(xiǎn)，加上逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂中的細(xì)胞，制約了 其臨床應(yīng)用的發(fā)展。

腺病毒載體
生產(chǎn)工藝相對(duì)成熟，成本低廉

腺病毒載體被廣泛用于溶瘤病毒、腺病毒載體疫苗等，重組腺病毒載體包括二型或五型，以五型最為常用。

目前常用的腺病毒包裝體系為AdEasy和AdMAX，均通過(guò)穿梭載體將目的基因重組到腺病毒骨架上。由于與腺病毒早期轉(zhuǎn)錄復(fù)制相關(guān)基因E1和E3在包裝系統(tǒng)是缺陷的（E3基因?yàn)椴《井a(chǎn)生非必須基因），因此腺病毒的包裝需要表達(dá)E1的細(xì)胞系，生產(chǎn)中常用穩(wěn)定表達(dá)E1基因的HEK293細(xì)胞作為腺病毒包裝系統(tǒng)。腺病毒載體的構(gòu)建技術(shù)相對(duì)更加成熟，并且可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，因此生產(chǎn)成本相對(duì)低廉。

由于腺病毒可以通過(guò)病毒毒液感染細(xì)胞的方式來(lái)擴(kuò)大病毒產(chǎn)量，因此相比于需要使用大量pDNA的AAV、慢病毒等病毒載體的生產(chǎn)，其成本非常低。