成人午夜又粗又硬又长_鲁一鲁AV2019在线_欧美深深色噜噜狠狠yyy_www.91色.com_色影音先锋av资源网_特级做A爰片久久毛片A片喷水_99精品无人区乱码1区2区3区_国产人妻久久精品一区_欧美午夜精品久久久久久浪潮_av免费无码天堂在线_蜜桃色欲AV久久无码精品软件_日美一级毛片_久久久久久久久性潮_国产乱对白精彩_日韩精品免费一区二区_亚洲欧美精品在线_无码国产69精品久久久久_开心五月综合激情综合五月_干一夜综合_亚洲中文有码字幕日本

合抗原受體(CAR)T細胞療法作為腫瘤免疫細胞治療領域的典型范例，已成為腫瘤治療歷史上里程碑式的成就。據Coherent Market Insights預測，在2018-2028年期間，全球CAR-T細胞治療市場規模的平均年復合增長將達46.1%，預計到2030年市場規模可達218億美元。

面對如此巨大的市場，藥企們也在加速布局，臨床進展不斷提速。數據顯示，全球在clinicaltrials.gov上注冊的CAR-T臨床項目已達700多項。縱觀國內，累計有近40款CAR-T療法正在研發中。隨著越來越多的CAR-T產品即將步入臨床，如何快速規模化地進行相對“個性化”的生產制備，并保證產品安全性和質量穩定性，是大家面臨的一大挑戰。
CAR-T細胞生產過程包括T細胞的富集和分離、CAR-T細胞的制備和終產品的低溫貯藏。其中制備過程包括T細胞在體外的激活與擴增、CAR基因的轉導、CAR-T細胞的擴增等步驟。本文簡要概述CAR的基因轉導與CAR-T細胞培養這兩個關鍵環節。

▲ CAR-T細胞產品的制備流程（圖源：網絡）

關鍵環節

1
CAR基因轉導

在基因轉導環節，CAR的結構設計、基因轉導方式、轉導效率等都是關鍵的影響因素。

自本世紀初，人們一直致力于修飾、改造CAR-T結構的胞內信號轉導區，根據“共刺激分子序列”結構的不同，CAR-T 細胞可分以下五代：

第一代CAR-T僅有胞外結構域、跨膜結構域和胞內信號轉導結構域組成，誘導T細胞激活僅通過CD3ζ信號域激活，缺少共刺激信號，細胞活性和效力很弱，需要外源性給予細胞因子；
第二代CAR-T中增加了一個4-1BB、或CD28、或OX40分子共刺激結構域，增強來自TCR-CD3的信號，細胞增殖能力和殺傷毒性都大大的增加，目前大多數產品使用的是二代CAR結構，如：諾華的Kymriah和吉利德的Yescarta；
第三代CAR-T增加了兩個或更多共刺激結構域，以提高CAR-T的活性和效力。但是第三代的臨床表現并不優于第二代CAR-T；
第四代CAR-T在二代的基礎上可表達特定的細胞因子（IL-2、IL-12、IL-15等），克服了腫瘤免疫微環境的抑制，通過修飾腫瘤微環境募集并活化其他免疫細胞進行免疫反應，進一步增強對腫瘤的殺傷作用；
第五代通用型CAR-T敲除異體T細胞上的TCR（T細胞抗原受體）、MHC以及相關信號通路基因，以避免異體型CAR-T細胞的宿主排斥反應。
目前，主要有兩種病毒載體用于CAR-T細胞基因轉導：γ逆轉錄病毒載體和慢病毒載體。其中慢病毒載體在科研和臨床開發中越來越受到青睞，主要因其具備以下優勢：
慢病毒更安全，更低的致癌轉化和隨機轉基因整合風險；
應用范圍更廣，可轉導分裂/非分裂細胞；可以轉導多種細胞，包括難以轉導的造血前體細胞、神經元細胞、淋巴細胞和巨噬細胞等；
慢病毒轉基因負荷量更大，可容納6.5kb的外源基因且基因毒性更小；
慢病毒介導的基因表達持續且穩定，并隨細胞基因組的分裂而分裂；
慢病毒生產成本較低；
慢病毒的轉導效率接近100%，高于γ逆轉錄病毒。‍

作為遞送基因的載體工具，高質量的慢病毒產品是CAR-T細胞藥物有效性及安全性的保證，因此其慢病毒產品的質量表征是關鍵。臨床試驗中要求準確調整病毒載體劑量和細胞轉導效率，并對最終產品進行嚴格的質量控制以保證其安全性。

目前慢病毒最精確滴度測量方法是，感染細胞后，使用qPCR來檢測整合到靶細胞基因組中的前病毒拷貝數。這種方法可以區分多個整合事件，減少低估病毒滴度的可能性。此方法的主要缺點是工作量較大，需要用病毒制劑的連續稀釋液轉化靶細胞，分離基因組DNA，并使用針對病毒成分或轉基因本身的引物來量化整合事件的數量。

表征細胞感染效率的關鍵參數是感染復數（MOI），即感染時病毒與細胞數量的比值。理論上MOI值越大，感染效率越高，但對細胞的毒性也越大，適宜的MOI值是高感染效率的關鍵因素之一。慢病毒的感染能力隨細胞類型的不同而不同，因此每種不同的細胞類型需要不同的MOI。理想情況下，MOI與感染細胞數量之間應呈線性關系。

然而由于病毒結構的復雜性，慢病毒產品的質控也很重要。慢病毒GMP生產的一些特異性檢測包括評估慢病毒載體的純度與特性，如蛋白質和DNA污染物；形態和基因組完整性；安全性，如可復制型慢病毒、外源性病原體，支原體，內毒素/熱原；病毒效力，如總/活性慢病毒顆粒；以及最終批次的其他理化性質，如pH、滲透壓、電導率。慢病毒規模化生產的產能、成本、質量等各方面都將直接影響著CAR-T產品最終的治療應用。

關鍵環節

2
CAR-T細胞擴增培養

在 CAR-T 治療過程中，需將經過技術改造的 T 細胞進行體外培養，達到符合治療要求的細胞數量后，再回輸到病人體內靶向殺死癌細胞。在CAR-T生產中，補充細胞因子以增強體外CAR-T細胞的增殖是一種常見的做法。IL-2可誘導T細胞擴增，通過調節IL-2濃度，可以增加早期記憶細胞數量。

另外，CAR-T細胞擴增還需要重點考慮如何保持CD4+和CD8+T細胞的平衡。而且，非轉導的T細胞在有外源刺激因子刺激時也可以擴增。擴增時間受限于技術和培養體系的選擇，通常需要1-2周。目前T細胞體外快速擴增仍然是一個挑戰，即使有細胞因子的參與，擴增的速度和穩定性仍然需要進一步的探索和優化才能實現。

目前，絕大部分企業的CAR-T細胞制備仍舊是純手動化生產，這樣的生產方式不僅導致產品被污染的風險增加，而且容易產生產品批次間差異。另外，CAR-T的生產過程需由B級條件下的生物安全柜保障全過程的無菌性，因此對生產人員的無菌操作提出了極高的要求。CAR-T細胞產品一旦被細菌污染，現有技術都無法對其進行除菌，因此，監管部門對細胞治療產品的GMP生產有著特別嚴格的環境清潔度和操作要求。環境監測必須嚴格驗證，實時監測。而且，CAR-T細胞療法是一種自體產品，不同患者的細胞之間應當避免交叉污染。

根據我國首個《CAR-T細胞制劑制備質量管理規范》，CAR-T細胞產品在生產時的每一個環節都應嚴格遵循臨床要求。
總之，CAR-T細胞產品作為“活的”藥品，與傳統生物制品相比，其在生產工藝、質量研究、質量控制、放行檢測和穩定性研究等方面均需要特殊考量，因此面臨的挑戰更大，需要更加全面和充分的分析方法來保證CAR-T細胞質量控制方法的穩定性和高效性。

參考資料：
1.https://mp.weixin.qq.com/s/upR5qqsaKyBT9-J1ZStQZA
2.Roddie Claire et al. Manufacturing chimeric antigen receptor T cells: issues and challenges[J]. Cytotherapy, 2018, 21(3) : 327-340.
3.Mansour Poorebrahim et al，Production of CAR T-cells by GMP-grade lentiviral vectors: Latest advances and future prospects，CRITICAL REVIEWS IN CLINICAL LABORATORY SCIENCES，Volume 56, 2019 - Issue 6
4.Tuazon SA , Li A , Gooley T , et al. Factors affecting lym phocyte collection effi- ciency for the manufacture of chimeric antigen receptor T cells in adults with B-cell malignancies. Transfusion 2019;59:1773–80
5.https://xueqiu.com/3483303916/218920271