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技術裝備
CAR-T細胞生產工藝中的關鍵環節有哪些?如何規模化、安全穩定的生產制備?
發布時間: 2022-09-19     來源: 制藥業

合抗原受體(CAR)T細胞療法作為腫瘤免疫細胞治療領域的典型范例,已成為腫瘤治療歷史上里程碑式的成就。據Coherent Market Insights預測,在2018-2028年期間,全球CAR-T細胞治療市場規模的平均年復合增長將達46.1%,預計到2030年市場規模可達218億美元。

面對如此巨大的市場,藥企們也在加速布局,臨床進展不斷提速。數據顯示,全球在clinicaltrials.gov上注冊的CAR-T臨床項目已達700多項。縱觀國內,累計有近40款CAR-T療法正在研發中。隨著越來越多的CAR-T產品即將步入臨床,如何快速規模化地進行相對“個性化”的生產制備,并保證產品安全性和質量穩定性,是大家面臨的一大挑戰。
CAR-T細胞生產過程包括T細胞的富集和分離、CAR-T細胞的制備和終產品的低溫貯藏。其中制備過程包括T細胞在體外的激活與擴增、CAR基因的轉導、CAR-T細胞的擴增等步驟。本文簡要概述CAR的基因轉導與CAR-T細胞培養這兩個關鍵環節。


▲ CAR-T細胞產品的制備流程(圖源:網絡)

關鍵環節

1
CAR基因轉導

在基因轉導環節,CAR的結構設計、基因轉導方式、轉導效率等都是關鍵的影響因素。

自本世紀初,人們一直致力于修飾、改造CAR-T結構的胞內信號轉導區,根據“共刺激分子序列”結構的不同,CAR-T 細胞可分以下五代:

第一代CAR-T僅有胞外結構域、跨膜結構域和胞內信號轉導結構域組成,誘導T細胞激活僅通過CD3ζ信號域激活,缺少共刺激信號,細胞活性和效力很弱,需要外源性給予細胞因子;
第二代CAR-T中增加了一個4-1BB、或CD28、或OX40分子共刺激結構域,增強來自TCR-CD3的信號,細胞增殖能力和殺傷毒性都大大的增加,目前大多數產品使用的是二代CAR結構,如:諾華的Kymriah和吉利德的Yescarta;
第三代CAR-T增加了兩個或更多共刺激結構域,以提高CAR-T的活性和效力。但是第三代的臨床表現并不優于第二代CAR-T;
第四代CAR-T在二代的基礎上可表達特定的細胞因子(IL-2、IL-12、IL-15等),克服了腫瘤免疫微環境的抑制,通過修飾腫瘤微環境募集并活化其他免疫細胞進行免疫反應,進一步增強對腫瘤的殺傷作用;
第五代通用型CAR-T敲除異體T細胞上的TCR(T細胞抗原受體)、MHC以及相關信號通路基因,以避免異體型CAR-T細胞的宿主排斥反應。
目前,主要有兩種病毒載體用于CAR-T細胞基因轉導:γ逆轉錄病毒載體和慢病毒載體。其中慢病毒載體在科研和臨床開發中越來越受到青睞,主要因其具備以下優勢:
慢病毒更安全,更低的致癌轉化和隨機轉基因整合風險;
應用范圍更廣,可轉導分裂/非分裂細胞;可以轉導多種細胞,包括難以轉導的造血前體細胞、神經元細胞、淋巴細胞和巨噬細胞等;
慢病毒轉基因負荷量更大,可容納6.5kb的外源基因且基因毒性更小;
慢病毒介導的基因表達持續且穩定,并隨細胞基因組的分裂而分裂;
慢病毒生產成本較低;
慢病毒的轉導效率接近100%,高于γ逆轉錄病毒。‍

作為遞送基因的載體工具,高質量的慢病毒產品是CAR-T細胞藥物有效性及安全性的保證,因此其慢病毒產品的質量表征是關鍵。臨床試驗中要求準確調整病毒載體劑量和細胞轉導效率,并對最終產品進行嚴格的質量控制以保證其安全性。

目前慢病毒最精確滴度測量方法是,感染細胞后,使用qPCR來檢測整合到靶細胞基因組中的前病毒拷貝數。這種方法可以區分多個整合事件,減少低估病毒滴度的可能性。此方法的主要缺點是工作量較大,需要用病毒制劑的連續稀釋液轉化靶細胞,分離基因組DNA,并使用針對病毒成分或轉基因本身的引物來量化整合事件的數量。

表征細胞感染效率的關鍵參數是感染復數(MOI),即感染時病毒與細胞數量的比值。理論上MOI值越大,感染效率越高,但對細胞的毒性也越大,適宜的MOI值是高感染效率的關鍵因素之一。慢病毒的感染能力隨細胞類型的不同而不同,因此每種不同的細胞類型需要不同的MOI。理想情況下,MOI與感染細胞數量之間應呈線性關系。

然而由于病毒結構的復雜性,慢病毒產品的質控也很重要。慢病毒GMP生產的一些特異性檢測包括評估慢病毒載體的純度與特性,如蛋白質和DNA污染物;形態和基因組完整性;安全性,如可復制型慢病毒、外源性病原體,支原體,內毒素/熱原;病毒效力,如總/活性慢病毒顆粒;以及最終批次的其他理化性質,如pH、滲透壓、電導率。慢病毒規模化生產的產能、成本、質量等各方面都將直接影響著CAR-T產品最終的治療應用。

關鍵環節

2
CAR-T細胞擴增培養

在 CAR-T 治療過程中,需將經過技術改造的 T 細胞進行體外培養,達到符合治療要求的細胞數量后,再回輸到病人體內靶向殺死癌細胞。在CAR-T生產中,補充細胞因子以增強體外CAR-T細胞的增殖是一種常見的做法。IL-2可誘導T細胞擴增,通過調節IL-2濃度,可以增加早期記憶細胞數量。

另外,CAR-T細胞擴增還需要重點考慮如何保持CD4+和CD8+T細胞的平衡。而且,非轉導的T細胞在有外源刺激因子刺激時也可以擴增。擴增時間受限于技術和培養體系的選擇,通常需要1-2周。目前T細胞體外快速擴增仍然是一個挑戰,即使有細胞因子的參與,擴增的速度和穩定性仍然需要進一步的探索和優化才能實現。

目前,絕大部分企業的CAR-T細胞制備仍舊是純手動化生產,這樣的生產方式不僅導致產品被污染的風險增加,而且容易產生產品批次間差異。另外,CAR-T的生產過程需由B級條件下的生物安全柜保障全過程的無菌性,因此對生產人員的無菌操作提出了極高的要求。CAR-T細胞產品一旦被細菌污染,現有技術都無法對其進行除菌,因此,監管部門對細胞治療產品的GMP生產有著特別嚴格的環境清潔度和操作要求。環境監測必須嚴格驗證,實時監測。而且,CAR-T細胞療法是一種自體產品,不同患者的細胞之間應當避免交叉污染。

根據我國首個《CAR-T細胞制劑制備質量管理規范》,CAR-T細胞產品在生產時的每一個環節都應嚴格遵循臨床要求。
總之,CAR-T細胞產品作為“活的”藥品,與傳統生物制品相比,其在生產工藝、質量研究、質量控制、放行檢測和穩定性研究等方面均需要特殊考量,因此面臨的挑戰更大,需要更加全面和充分的分析方法來保證CAR-T細胞質量控制方法的穩定性和高效性。

參考資料:
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