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質粒工藝化生產流程包括逐級放大的菌體擴增過程和下游純化過程，細胞與基因治療中最常用的載體AAV和慢病毒的生產都需要質粒作為起始材料，因此每年需要大量符合質量要求的質粒來滿足下游細胞與基因治療的市場需求。

質粒生產工藝中面臨的最大挑戰是大規模的生產放大和純化，即要維持高超螺旋結構質粒的比例，又要保持高純度，以上兩點無論對于DNA疫苗還是對于下游病毒生產的效率與質量 （如減少空殼率等）形成重大影響。 

質粒通常在大腸桿菌中發酵擴增，提高大腸桿菌的生長密度可擴大質粒的產量。但細菌密度增加會帶來溶氧不足的問題，不僅會降低質粒產量，還會導致質粒質量下降，具有超螺旋構象的質粒含量減少，給下游純化工藝帶來困難，也會間接提高生產成本。對大腸桿菌發酵過程中的溶氧量問題進行優化后，可使質粒產量提高1至50 倍。

大腸桿菌的裂解包含化學方法（堿、洗滌劑、酶、滲透沖擊）和物理方法（加熱、 剪切、攪拌、超聲波和凍融），其中堿性裂解是最常用的方法。堿裂解步驟中，pH 的控制和適當有效的混合是關鍵，需要在狹窄的pH范圍內使基因組DNA發生不可逆變性且質粒雙鏈需要保持完整，大規模質粒生產中，裂解過程往往工藝重復性差， 難以控制；該階段的質粒對剪切力非常敏感，質粒損失較大，超螺旋也容易丟失， 影響產量和質量。 

質粒生產過程中常用層析法或色譜法進行純化，不同開發階段和使用級別對質粒的質量要求不同。質粒純化的目的在于去除宿主DNA、RNA、蛋白和內毒素以及非超螺旋的質粒變體，以滿足針對目標產品的使用要求，純化過程的優化可提高質粒產量、降低成本。質粒作為細胞與基因治療藥品的生產原料，需要對其理化性質進行鑒別，確保目的基因序列及整合無誤；作為關鍵原材料或終產品，需要對其功能進行鑒定和控制；為保證安全性，對內毒素、雜菌污染和支原體殘留的鑒別和檢測的周期往往約30天左右，決定著質粒生產批次放行的周期；此外，質粒因為無法終端滅菌，因此需要全程在封閉且獨立的生產車間進行，且要避免交叉污染，因此自動化、封閉式的系統是未來趨勢。

當使用高拷貝數質粒、采用優化的發酵工藝可獲得約1-2g/L的質粒，但目前行業內絕大部分公司的質粒產量不到0.5g/L，工藝優化的空間還非常廣闊。質粒由于結構簡單，且理化性質相似，因此構建一個平臺化的生產和純化工藝相對簡單。質粒生產周期較短，上游發酵和下游純化罐裝工藝約需6天，但質粒的質量控制約需30天（主要對支原體等檢測周期較長），質粒生產的年產能可達100批次。
綜上，質粒生產的工藝優化對于提升質粒的產量和質量具有極大的意義，在大腸桿菌大規模發酵、質粒的提取和純化工藝上，目前仍然具有非常廣闊的優化空間。

綜上，質粒生產的工藝優化對于提升質粒的產量和質量具有極大的意義，在大腸桿菌大規模發酵、質粒的提取和純化工藝上，目前仍然具有非常廣闊的優化空間。

病毒載體
高昂的生產成本是細胞
與基因治療商業化的痛點

AAV生產成本
其關鍵在于質粒和細胞培養體系

HEK293細胞/三質粒系統是AAV生產的主流系統：AAV生產系統包括HEK293細胞/三質粒系統和依賴于昆蟲桿狀病毒、腺病毒、單純皰疹病毒或痘病毒的包裝系統。以HEK293細胞/三質粒系統和昆蟲桿狀病毒系統最為常見，但由于昆蟲桿狀病毒系統的單個細胞生產效率低、病毒活性低等特點，目前業內最主流的還是采用HEK293 細胞/三質粒生產系統。

AAV載體生產成本的控制較為關鍵。據Nature Reviews Drug Discovery披露，目前約有238個基于AAV的細胞與基因治療臨床試驗正在開展，是臨床試驗中使用最多的病毒載體之一。AAV細胞與基因治療產品價格高昂的主要原因在于其工業化生產的多個方面未得到全面優化，如何降低成本、擴大商業化生產能力是AAV基因治療產業化的最大難題。我們以AAV的生產工藝過程為基礎，分析AAV載體生產過程中的成本控制關鍵。

質粒是AAV生產成本的主要來源：根據Polyplus公司披露，AAV載體生產過程中， 質粒約占了生產成本的40-60%，除此以外，細胞和培養基以及血清約占生產成本的 20-30%。質粒價格約為10-30萬美元/g，質粒用量大約為1μg/106個細胞。對于病毒載體生產，每升生物反應器大約平均需要0.5mg質粒DNA進行瞬時轉染細胞，各廠家依據所用轉染試劑的不同，每升生物反應器的質粒需求量也有所差異。因此優化的質粒生產工藝（提升產率與質量）和減少下游質粒的使用量（如開發效率高的轉 染試劑）能大幅降低AAV載體生產成本。

懸浮培養是AAV生產的未來趨勢：AAV的規?；a包括貼壁培養體系和懸浮培養體系。傳統的貼壁培養工藝放大難、人力需求高且必須使用血清，達到的細胞密度低，因而產量更低；微載體或片狀載體培養系統在提高細胞產量的同時還能大大減少人力成本，但是最大的缺點在于高效轉染難；而懸浮細胞培養技術能更大程度滿 足臨床規模生產，并且無血清懸浮培養能減少血清的使用，不僅能降低生產成本，還能簡化下游純化技術（上游生產不需要添加血清）。然而，懸浮培養技術發展的難點在于細胞易成團并且馴化無血清懸浮細胞系的過程比較難，耗時長。然而，基因治療方式從局部給藥拓展到系統性給藥過程中，基于AAV的基因治療藥物治療劑量也將指數級增加，成本也相應的大幅提升，因此開發生產成本更低的懸浮培養模式代表著未來發展方向。

目前大部分公司正在從貼壁培養技術過渡到懸浮培養技術，據CRB披露，約有65% 的公司正在建設或預計建設懸浮細胞病毒載體生產平臺。國內宜明細胞的200L無血清AAV制備平臺采用懸浮細胞培養技術，可制備包括rAAV2、rAAV5、rAAV8和rAAV9 等多種符合GMP的AAV血清型，病毒產量可高達1E14vg/L，細胞的密度可達1E7 cells/mL。

Pall公司Emmanuelle Cameau等人于2019年在Cell & Gene Therapy Insights上對不同培養體系下AAV生產成本進行了拆分，懸浮培養體系單劑量的生產成本為 11953美元，相比細胞工廠的成本15152美金，降低了20%，質粒DNA是生產成本的主要來源之一，成本占比約38%；采用Pall的iCELLis固定床生物反應器，能提高細胞濃度和轉染效率，大大減少質粒用量，因此進一步降低了生產成本，單個劑量的AAV生產成本僅7723美金至9654美金，質粒成本占比降低至20%以下。綜上，對培養體系的優化對于AAV生產成本的降低至關重要，培養體系的優化方向主要在于增加細胞培養密度、減少質粒用量并提高轉染效率。

高質量的轉染試劑是AAV生產的核心要素，決定了質粒用量、病毒得率和純度：轉染試劑在很大程度上決定了質粒的用量、病毒得率和純度。大規模生產上常用的轉染方式有兩種，磷酸鈣轉染法和PEI轉染法（聚乙烯亞胺），賽默飛的LIPO 2000（一 種脂質體）轉染效率最高，然而價格昂貴，大規模生產中使用較少。磷酸鈣轉染的 優點為價格便宜，但缺點為效率非常低，并且誤差很大，很難達到工藝的一致性， 因此難以用于臨床級病毒載體的生產。目前主流的方式為PEI轉染法，PEI為陽離子聚合物，可以與帶有負電荷的核酸結合從而形成復合體通過內吞作用進入細胞中， 成本相對較適中。

PEI決定了達到高轉染效率時所需的質粒用量。據轉染試劑供應商Polyplus數據顯示，PEI轉染HEK293細胞時所需質粒用量約為1~2.5 μg/106個細胞，這決定了病毒生產時需要大量的質粒。因此對于PEI的優化可以減少質粒用量、提供病毒生產效率，從而降低成本。Polyplus的FectoVIR-AAV轉染體系使用PEI轉染后，使病毒生產中的空殼率有效降低，病毒產量實現提升2至10倍，并且病毒的感染能力也大大提升，同時質粒的用量能減少1/3，使得單個批次的生產成本得到大幅降低。

AAV生產下游工藝復雜，整體回收率低：AAV病毒載體生產的下游工藝包括細胞裂解、澄清、核酸酶處理、超濾、色譜柱純化、超濾濃縮、除菌過濾及罐裝等，涉及的工藝復雜。由于AAV常用于在體的基因治療，因此對純度和濃度的要求都非常高。

下游需要有較強的純化能力，用于去除工藝相關雜質和產品相關雜質，特別是空殼病毒。工藝相關雜質如細胞基質、細胞培養和發酵培養基組分等的去除相對容易，可采用核酸酶、超濾和親和層析的方式去除；而產品相關雜質如空殼病毒、聚集體和降解產物等較難去除，特別是空殼病毒，其在患者體內不僅會競爭細胞表面有限的受體，而且還有引起過度免疫反應的隱患。由于當將它們輸注給患者時，一方面會競爭細胞表面有限的受體數量；另一方面對基因治療無益處，還有可能引起副反應。由于空殼病毒和完整病毒僅等電點存在細微差異，因此分離困難，通過高分辨率陰離子交換樹脂可以降低空殼比。

為了得到最佳收率和分離效率，不同的AAV血清型需要設計不同的層析方案。原因在于AAV血清型與陰離子交換填充的結合特性不同，Benjamin Adams等在 Biotechnology Bioengineering對AAV的精制層析進行了研究，指出AAV5需要在偏酸性條件下才能有效地與陰離子交換填料結合，而AAV8則在偏堿性條件下最佳。所以工藝上難以針對AAV設計一個平臺化的通用純化方法，從而增加了生產成本。

為了達到治療所用的AAV濃度，原液產物通常需要濃縮100倍至10000倍，下游純化 也會有部分損失，因此對GMP設備提出了較大的挑戰。上游工藝獲得的病毒約為 1E4-5E5vg/細胞的載體滴度，粗收獲液中的單位體積滴度約為1E10-2E11vg/mL， 而AAV的臨床給藥范圍通常為1E12vg/kg/mL-1E14vg/kg/mL，因此產物需要濃縮達100倍至10000倍。AAV的下游整體回收率僅30-40%，還存在很大的優化空間，提升下游回收率可大幅增加產量，控制生產成本。

系統性給藥方式對AAV的需求量增加，成本更會成為商業化的一大痛點。根據Nature Reviews Drug Discovery的數據顯示，從局部眼睛的用藥到肌肉、血液等大范圍、 系統性的用藥，其所需病毒載量呈現10至10000倍增長，局部給藥與系統給藥劑量具有數量級的差異。從支付端來說，直接導致了大范圍系統性給藥的價格的大幅提高，例如針對眼部疾病的Luxturna售價為85萬美金，而肌肉給藥的Zolgensma售價達210萬美金；從成本端來說，未來針對系統性給藥的治療方式，成本和難以滿足的需求更會成為商業化的一大痛點。

總的來說，作為目前臨床試驗使用最多的病毒載體，AAV的生產成本控制至關重要， 不僅能降低上游CDMO企業的成本，還能使終端產品價格降低，提升病人用藥的可及性。AAV基因治療產品高昂成本的降低可以從優化培養體系、提高質粒轉染效率、 提升下游回收工藝和構建通用的AAV純化平臺等方面入手，注重布局以上工藝體系 的細胞與基因治療CDMO企業，必將在行業中占據優勢地位。

慢病毒載體
其純化生產工藝中的最大瓶頸

慢病毒載體能整合進宿主細胞基因組和不具有組織特異性的特點，使慢病毒載體被廣泛用于體外細胞基因治療中。CAR-T、UCAR-T、CAR-NK和干細胞產品主要使用慢病毒載體。目前常用的第三代慢病毒載體系統由四質粒構成，其中三個質粒為標準化的質粒，另一個包含目的基因的載體質粒為個性化的質粒，同AAV一樣，質粒也是慢病毒載體生產的一個重要成本來源。第三代載體系統增加了兩個安全特性， 一是構建自失活的慢病毒載體，二是用異源啟動子序列代替Tat基因，更加安全。

懸浮無血清培養逐漸替代貼壁培養體系：慢病毒的懸浮無血清培養已逐步替代傳統的貼壁培養模式，慢病毒貼壁培養的制備需要使用大量進口血清，而這些進口血清價格高昂，是成本中不可忽略的因素，慢病毒懸浮無血清培養可以極大地降低生產成本。另外，貼壁培養中，Cell stack替代細胞工廠也是一個趨勢。

慢病毒載體理化性質不穩定，活性易喪失，回收率低，下游純化工藝是關鍵：慢病毒載體的上游工藝難以產生差異化，最大的挑戰在于慢病毒載體的純化過程。慢病毒載體由于具有包膜結構，理化性質不穩定，對剪切力敏感，因此下游工藝中的回收率較低，通常只有10%左右，優化后的回收率大概為30-40%，滴度大約為106 -108TU/mL，因此對下游純化工藝的開發和優化是慢病毒規?；a的瓶頸和關鍵。

慢病毒載體生產成本測算：根據 Ruxandra-Maria Comisel 等 在 Biochemical Engineering Journal中對五種不同細胞培養體系下慢病毒載體的生產成本（GOG） 進行了測算（基于模型假設），并且基于此對慢病毒載體的生產成本進行拆分，細胞培養體系為10層細胞工廠（CF10）、中空纖維生物反應器（HF）、固定床生物反應器（FB）、微載體搖擺式生物反應器（RMmc）和懸浮培養下的一次性攪拌槽式生物反應器（SUB（STR））。

不同培養體系下成本測算：SUB、RM和FB可獲得最大程度的規模效應，隨著規模放大到生產10,000劑量，每劑量的慢病毒生產成本可低至1200美金；CF10和HF難以實現規?；?，每劑量的生產成本分別約38000美金和9300美金。因此，懸浮培養、固定床生物反應器和微載體對于規?；a慢病毒載體最為經濟，可有效降低生產成本。

慢病毒生產成本拆分：假設慢病毒的年產量為1000劑/年，HF和CF10的上游一次性耗材的成本占比達82%和34%，是生產成本的主要來源；而在規模化培養體系如 RMmc600、SUB500和FB333下，質粒和轉染試劑花費是生產成本的主要來源，占比約46%、41%和36%。綜上，慢病毒載體生產成本主要來自上游一次性耗材和質粒轉染體系，發展規?；a、開發不依賴轉染系統的穩定細胞培養體系是降低成本的關鍵所在。

逆轉錄病毒載體
生產技術門檻高，成本相對更低，轉染效率更高

逆轉錄病毒載體生產技術門檻高，需要一定的技術積累，但其發展比較早，因此工藝生產相對更加完善。逆轉錄病毒能通過穩轉細胞系進行生產，因此產品質量相比 慢病毒載體更加穩定，工藝放大容易，單個批次生產的逆轉錄病毒載體可供500名病人進行細胞治療。Kite和Brammer公司均采用逆轉錄病毒載體技術進行基因治療研 究，Kite的Yescarta以PG13-CD19-H3穩轉細胞系為起始物料。

逆轉錄病毒的成本更低：相比于慢病毒載體，逆轉錄病毒載體的成本低10倍以上。Novartis的Kymriah采用慢病毒載體進行制備，定價為47.5萬美元，Kite的Yescarta 采用逆轉錄病毒進行制備，定價為37.3萬美元，相較于Kymriah降低了約21.5%。原因在于慢病毒載體的生產需要毫克級別的質粒進行轉染，而逆轉錄病毒載體僅需微克級別的質粒，在大規模生產上大大節約了成本。

逆轉錄病毒的感染效率更高：逆轉錄病毒的感染效率高，應用于細胞治療時相對于慢病毒來說，CAR的陽性率也更高，因此盡管逆轉錄病毒的生產工藝門檻高，但從長遠的應用和效益來看，逆病毒載體仍然具有很大的優勢。

逆轉錄病毒的插入毒性是其臨床應用發展的障礙。早期的體外細胞與基因治療多采用γ-逆轉錄病毒作為遞送載體，直到在治療一項X連鎖的重癥聯合免疫缺陷病的臨床試驗中，γ-逆轉錄病毒在9位受試者中造成了4位受試者發生了T淋巴細胞白血病的嚴重副反應，γ-逆轉錄病毒的安全性再次受到質疑，慢病毒載體的臨床使用逐漸增多。盡管兩種載體都能插入到基因組中，但γ-逆轉錄病毒載體更傾向于整合到轉錄起始位點附近，更容易具有致癌風險，加上逆轉錄病毒只能感染分裂中的細胞，制約了 其臨床應用的發展。

腺病毒載體
生產工藝相對成熟，成本低廉

腺病毒載體被廣泛用于溶瘤病毒、腺病毒載體疫苗等，重組腺病毒載體包括二型或五型，以五型最為常用。

目前常用的腺病毒包裝體系為AdEasy和AdMAX，均通過穿梭載體將目的基因重組到腺病毒骨架上。由于與腺病毒早期轉錄復制相關基因E1和E3在包裝系統是缺陷的（E3基因為病毒產生非必須基因），因此腺病毒的包裝需要表達E1的細胞系，生產中常用穩定表達E1基因的HEK293細胞作為腺病毒包裝系統。腺病毒載體的構建技術相對更加成熟，并且可以實現大規模懸浮細胞培養，因此生產成本相對低廉。

由于腺病毒可以通過病毒毒液感染細胞的方式來擴大病毒產量，因此相比于需要使用大量pDNA的AAV、慢病毒等病毒載體的生產，其成本非常低。