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無菌生產工藝是無菌原料藥制備過程中難度最大的工藝驗證之一，由于許多原料藥無法最終滅菌，原料藥在進行過濾、干燥、粉碎、分裝等操作過程中就必須盡可能地避免被微生物污染。影響產品是否無菌的因素相當多，如生產的設計及其設備布局、生產環境狀況、所有與生產相關的設備及物料的污染狀況、人員操作和衛生狀況等，每一個環節對最終產品的質量都舉足輕重。為了確保無菌生產工藝系統無菌的可靠性和適應性，將需要通過一系列的驗證來確保產品的無菌性。

無菌工藝驗證需要解決很多問題，如模擬介質的選擇、無菌工藝驗證的相關要求、設備的滅菌、如何達到全培養的目的、達到無菌的組織保證以及最終結果分析等，任何一項問題沒有處理好，都會對最終結果造成影響。

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模擬介質的選擇

無菌原料藥對模擬介質的選擇很關鍵，選擇的模擬介質應有如下特征：

沒有抑菌作用。若模擬介質有抑菌作用，將會對生產系統中的細菌生長產生抑制作用，以至于不能培養出細菌，產生假的結果。模擬介質最好具有促進細菌生長的作用。如果選擇對細菌生長有促進作用的固體培養介質做驗證，對生產環境的保護則特別重要。因為，如果有些操作是使介質暴露的，介質的塵粒會飄散到某些較難清洗的地方，如空調系統的送風口和回風口附近，給細菌在該處的滋生創造了條件，所以應有措施保護不易清洗的死角不被介質污染。

模擬介質還應有較好的溶解度。因為若溶解性能不好，懸浮在培養基中的模擬介質使培養基發生混濁，影響結果的判斷。

模擬介質加入培養基后，不應影響培養基的質量，pH不發生大的變化，以適應大多數細菌的生長。

對設備沒有腐蝕性，對人體無害，對環境不發生污染。

選擇模擬介質，需要根據各公司的具體情況而定，目前多數廠家采用培養基灌裝試驗來證明其無菌工藝的可靠性。所用的培養基應有較好的溶解性，營養程度要高，能夠滿足多種微生物的生長。一般通過生長促進試驗驗證。如生產工藝是在厭氧條件下，選用的培養基應能夠使厭氧微生物生長。

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無菌工藝驗證的相關要求

驗證前的準備
生產設施的設計和確認

生產設施的設計應能使潛在的污染降低到最小。例如，生產設施應易于清潔和消毒、產品或物料敞開之處的空氣要有一定的質量要求、溫度和濕度的控制要適宜、穿著無菌衣的操作人員感到舒適、能防止污染和交叉污染等等。應重視設計上的細節，減少污染源，以確保無菌生產得以實施。無菌工藝驗證是執行難度較大的驗證之一，參與者應充分意識到設施的設計和確認，其是驗證成功的主要因素。
公用工程的確認

影響產品質量的公用工程(如蒸汽、壓縮空氣、加熱、制冷、水系統等)都應經過確認。公用工程是生產得以正常實施的保證之一，若其中任何一個系統出現故障，將會使產品發生潛在的或嚴重的污染。應有公用工程的維護計劃并按計劃執行，目的就是不讓系統發生故障，保證生產的順利進行，而不是發生故障后去修理，經常發生故障而被維修的公用工程是不能保證無菌生產的。

設備和工藝確認

驗證實施之前，所有的設備、無菌環境、計算機控制系統以及生產工藝都應經過驗證。產品暴露是發生污染使無菌工藝驗證失敗的主要原因之一，為防止或降低污染發生的幾率，給暴露產品提供層流空氣的百級層流罩或隔離器是非常重要的，同樣被滅菌過的物品由滅菌器到生產線的傳遞和經由必要的手工操作進入生產線前的保護也是至關重要的，應盡量避免人員對設備或物料接觸的操作。這些都應經過驗證。

設備的清洗和滅菌

在無菌工藝驗證之前接觸模擬介質的設備表面應清洗滅菌，并防止滅菌后的再污染。若生產的藥品具有抗菌性或者殺菌性，這種清洗尤為重要，要確認清洗后對微生物沒有抑菌性，或可以有效的消除抑菌性。若清洗或滅菌不徹底，殘存的藥品會使模擬介質受到污染或設備表面的微生物使模擬介質染菌而使驗證失敗。這種清洗和滅菌過程應經過驗證，以保證清洗徹底和滅菌成功。

設備滅菌是無菌工藝驗證的關鍵的一環，所有與工藝相關的設備都必須滅菌，首先設備的滅菌要通過滅菌驗證，包括最冷點的確定、溫度分布和熱穿透、生物指示劑的挑戰，最終確定滅菌的溫度、時間和排氣點。所用的生物指示劑應確認其類型、來源、菌種的濃度和D值。

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無菌工藝驗證的組織保障

為了保證無菌工藝驗證的順利執行，成立無菌工藝驗證執行小組，目的是：(1)為驗證工作提供人、財、物支持；(2)最終決定驗證期間發生各種事務的處理；(3)批準驗證方案和計劃及驗證報告；(4)分別負責各子小組的工作。

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無菌工藝驗證的過程

無菌工藝驗證的設計，應充分體現QbD（質量源于設計）的理念，盡可能地與工藝過程符合，最大限度地保證產品的質量。

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標準操作規程的確認以及人員培訓

標準操作規程（SOP）是指導操作人員進行某項操作的書面程序，是操作人員的操作標準，是生產操作成功的關鍵。標準操作規程應能對操作人員提供足夠的指導以完成本項操作。

標準操作規程應由技術人員編寫，部門主管審閱，質量保證部主管批準。將批準后的標準操作規程對操作人員進行培訓，使之真正理解并能熟練掌握。標準操作規程的原件及培訓記錄存放在資料管理部門，操作現場存放的是復印件。驗證前應確認每一項操作有標準可依，以免造成管理上的漏洞，且確認這項操作已被培訓過，同時操作人員已能熟練掌握。

驗證之前應對所有的操作人員和質量管理人員培訓與驗證有關的各項操作（可根據驗證方案和SOP），以避免驗證過程中有關人員不理解甚至不知道怎么做，保證驗證的順利實施。如果生產車間新增加或調換的無菌操作人員超過20％，應重新做無菌工藝驗證，以保證無菌操作能順利進行。

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儀表校正

儀表校正應由有資格的人員或單位按照公司批準過的SOP來進行，并符合國家可追蹤的標準。儀表的校正頻率至少符合國家規定，并根據使用頻率調整并嚴于此標準。使用頻率越高，儀表的磨損越厲害，校正頻率就應越高。由于使用沒有經過校正的儀表，所得的數據無效。

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工藝條件

無菌原料藥的生產工藝具有其自己的特點：設備種類多、設備復雜、管路長，且不同的生產工藝有不同的特點，根據各自的特點選擇固體或液體模擬介質。雖然，已盡量地減少設備的內部暴露和減少物料產品的暴露，但是不可避免地會有一些設備與外界環境相通，或是物料暴露在環境中，這些開口處應有呼吸器或百級層流空氣的保護，更好的是使用隔離器保護。驗證時，應有模擬這些物料暴露的操作。

有些生產工藝中具有結晶的操作，這使得模擬過程有些困難，因為結晶過程中有相變產生，應該考慮這種變化是否會影響到微生物的生長。最好的辦法是選擇兩種模擬介質，它們在結晶過程發生反應生成另一種模擬介質。選擇這樣的介質可能會有很大困難，簡單起見，也可用同一種液體模擬介質模擬結晶過程流經所有管路加到結晶罐中。若結晶過程有加晶種的操作，模擬過程中也應有這樣的操作。晶種可用模擬介質代替。為使晶體粒度均勻，有些結晶過程有降溫過程，在模擬過程中不應降溫，因為微生物在低溫下不易生長。

干燥過程中的溫度一般會抑制微生物生長，甚至將微生物殺死，在模擬過程中應保持室溫，以免溫度太高殺死細菌而使驗證失敗。也有用冷凍干燥除去濕分的，模擬凍干參數的選擇也不應使細菌的生長受到抑制。

總之，在驗證過程中盡量使工藝參數和實際情況一致，但是為了使微生物生長良好，允許選擇的工藝參數和實際情況不一致，但是這些參數不應和生產工藝產生重大差別。無菌原料藥的分裝劑量一般較大，在這種情況下分裝過程中應減慢分裝速度，以增加產品暴露的可能，在最差狀況進行操作。

在進行驗證時，應根據生產過程中曾經出現的異常情況或者可以預想的可能的異常情況設置最差條件，以考察生產過程中出現此異常情況時產品的無菌性質是否會受到影響。

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操作時限

在原料藥的生產中，每一操作都應有操作時限來保證已滅菌的物品避免受到微生物的污染或產品降解。操作時限越長，產品受污染的幾率越大。

在無菌工藝驗證時，應將操作時限調整至最大，在最差狀況下操作，如果這時驗證結果可靠，那么在小于此時間下進行的操作當然也是可靠的。尤其是已滅菌物品由滅菌到使用時的保存時間更加重要。在驗證時，應將已滅菌物品至少放置到規定的保存時間，這樣的驗證結果更具說服力。每一步操作都應延長甚至超過操作時限，這樣會使得總的工藝時間很長，但是這樣的驗證結果更能保證正常生產時的無菌狀態。

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環境監測

在驗證過程中環境的質量至關重要，應在惡劣的環境下進行操作，但是不能惡劣到使產品發生染菌的程度。一般采用增加操作人員數量的辦法惡化環境。應對環境進行監測以評價驗證過程，所有暴露產品的操作都應同時監測本區域的環境。環境監測包括以下幾個項目：無菌室的溫度、濕度、塵埃粒子、沉降菌、浮游菌、人員和表面微生物。

沉降菌和浮游菌用培養皿進行測試，培養基為營養瓊脂或其他適宜的培養基。培養皿應放置在微生物監測史上情況最差的部位。在驗證過程中應增加取樣的頻率，并且應在分裝區域放有2個以上的取樣培養皿連續暴露取樣，暴露時間應為分裝的全過程，但不宜超過4h，否則營養瓊脂變干而不能提供足夠的營養使細菌不能長出。若工藝時間超出4h，應重新放置一個新的培養皿進行監測。營養瓊脂在使用前應做微生物生長促進試驗，以保證營養瓊脂對微生物生長的適應性。

方法如下：選擇合適數量的營養瓊脂培養基（此數量具有統計學意義），分別接種10-100CFU的金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、白色念珠菌（Candidaalbicans）、黑曲霉（Aspergillusniger）和環境中的檢出菌。細菌分別置于（32.5±2.5）℃的環境中培養不超過3天，真菌置于（22.5±2.5）℃的環境中，分別培養不超過5天。接種的微生物生長良好。測試浮游菌可以用縫隙—瓊脂撞擊采樣法、離心采樣法、液體撞擊采樣法及膜過濾法。一般說來，浮游菌比沉降菌更能反映環境的質量。表面微生物的測試可用擦拭法或Rodac碟。擦拭法用于非規則表面的微生物測試，用擦拭法測表面微生物之前應先測回收率。影響回收率的因素很多，包括微生物的種類和數量，不同的操作人員進行測試會得到不同的回收率，主要原因是擦拭時用力的大小，每個測試操作人員有自己的回收率數值。測試回收率時，不要選擇生命脆弱的微生物，因為這些微生物被擦拭時會死去，產生不可信的結果。用Rodac碟測試規則表面的微生物污染程度比較方便，但是這種測試會有營養物質殘留在被測試的表面，應清洗干凈，否則這是一個很大的污染。塵埃粒子盡可能使用在線監測，取樣點數和取樣量符合現行的法規的要求，監測的結果應能證明在產品暴露的關鍵區域空氣質量達到了100級潔凈區的空氣質量標準。

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工藝過程的模擬和全培養

由于一般原料藥生產工藝都經過結晶過程，其間會發生相變，因此無菌工藝驗證不可能完全按照原來的實際工藝來進行模擬。

從原材料配制起，以培養基作為模擬介質，經過除菌過濾、結晶、過濾、洗滌幾個步驟后，為了保證所用的介質是全部用于無菌檢驗，需要對多余的模擬介質采取措施進行全量培養，以保證所用介質的完整性。以后的干燥、粉碎、分裝步驟再按生產工藝進行。為了考察各步驟的無菌狀況，要在各個階段進行取樣，模擬生產過程中的取樣，不要刻意地增加取樣點。取樣的樣品也要進行培養，以達到全面培養的目的。為了保證取樣的無菌性，對取樣口進行滅菌，如果不能使用蒸汽滅菌，可以使用殺孢子劑滅菌，但在取樣前要保證殺孢子劑殘留沒有抑菌性。

生產過程中可能有升溫、降溫過程，此時應注意模擬介質對溫度的敏感性?？赏ㄟ^實驗室考察。

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樣品培養

陰性對照：在驗證過程中，隨機取出有代表性的一定數量的裝有培養基的包裝容器作為陰性對照。

陽性對照：驗證過程中，隨機取出有代表性的一定數量的裝有模擬介質的包裝容器，1/3接種濃度為<100CFU的5種標準菌株和環境的檢出菌，接種后細菌在（32.5±2.5）℃環境下培養48～72h，霉菌和酵母菌在（22.5±2.5）℃培養5天，接種包裝容器中均有明顯的所接種微生物的生長，以此作為陽性對照。

樣品培養：將分裝得到的產品在操作現場灌裝培養基，然后密封，檢查密封性。全部產品應在（22.5±2.5）℃和（32.5±2.5）℃分別培養7天，總培養14天，每天檢查全部樣品的微生物生長情況。若發現污染應注明批號、包裝容器號，同時檢查密封情況。若有破損注明原因。污染的樣品應做微生物鑒別，鑒別到種。

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結果評價及再驗證

在制劑中填充低于5000單元接受標準為0污染，但是在無菌原料藥生產中，包裝單位較大，得到的總分裝容器數一般較小，這使得抽樣測試和結果計算失去統計學意義，又因為生產批量是固定的，因此所有產品都應被培養，并且所有的陰性對照和陽性對照都必須合格。若陰性對照或陽性對照不合格，則無菌工藝驗證失敗需要重新做。若發現有一個容器長菌，就認為無菌生產工藝中有染菌的因素存在，應立即停產，調查產生污染的原因，采取措施后重新做驗證。

新生產線在投產之前要做無菌工藝驗證，驗證通過后該生產線才能投入使用。正在運行的生產線應每年做2次無菌工藝驗證，每個可能進入潔凈區或與生產接觸的人員每年至少參加一次無菌工藝驗證。對于廠房經過大修、主要設備更換以及新建廠房等情況應進行至少連續3個周期的無菌工藝驗證。如果是周期性的再驗證，如果在該兩次驗證期間沒有發生產品的染菌，可進行一個運行周期的驗證就足夠了；如果該驗證通過，則證明該系統能夠穩定地保持無菌性；如果該驗證失敗，應該詳細地調查原因并消除隱患后，再重新進行至少連續3個周期的驗證，只有所有驗證全部通過，才能認為本無菌生產工藝是可靠的。

如果在兩次驗證期間發生過產品染菌情況，經過調查和細菌鑒別，確定染菌原因是由可以控制的因素造成，或染菌因素比較輕微，改正這些失誤后可以繼續進行生產；如果進行調查及細菌鑒別不能確認染菌原因，則應對無菌生產系統進行無菌工藝驗證以確認哪些環節造成系統染菌，并對這期間生產的產品進行無菌風險的調查和評估。

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驗證報告

驗證完成之后應起草一份驗證報告，對以上內容做一個簡要總結，主要包括以下內容：驗證題目、驗證目的、參加驗證部門和人員、人員的培訓、采用的工藝參數和操作時限、選擇的模擬介質和培養基、模擬過程中的中斷、偏差及其調查、培養條件和最終結果，最終報告應由企業質量負責人批準。只有當最終結果合格并且最終報告經過批準后，企業的無菌原料藥生產才能開始（或繼續）進行。